1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一．本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等
1.研究意义
菘蓝isatis indigotica ft.为十字花科植物,主要分布在华东各省、河南、山西等地,有
2. 研究的基本内容和问题
二．研究的目标、内容以及拟解决的关键问题
1.研究目标
（1）建立菘蓝组培再生体系；
3. 研究的方法与方案
三．研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
1.研究方法
（1）种子消毒方案
表1 种子消毒方案
| 编号 | 75酒精处理时间（s） | 0.1次氯酸钠处理时间（min） |
| 1 1 | 30 | 8 |
| 2 | 30 | 10 |
| 3 | 30 | 12 |
（2）发芽培养基筛选方案
表2 发芽培养基
| 编号 | 培养基 | 6-BA（mg·L-1） | NAA（mg·L-1） |
| 1 1 | MS | 1.0 | 0.0 |
| 2 | MS | 1.0 | 0.2 |
| 3 | MS | 1.0 | 0.5 |
| 4 | MS | 3.0 | 0.3 |
（3）诱导分化培养基
表3诱导分化培养基
| 编号 | 外植体 | 6-BA（mg·L-1） | NAA（mg·L-1） |
| 1 1 | 下胚轴 | 0.0 | 0.0 |
| 2 | 下胚轴 | 0.5 | 0.1 |
| 3 | 下胚轴 | 1.0 | 0.2 |
| 4 | 下胚轴 | 2.0 | 0.5 |
| 5 | 子叶 | 0.0 | 0.0 |
| 6 | 子叶 | 0.5 | 0.1 |
| 7 | 子叶 | 1.0 | 0.2 |
| 8 | 子叶 | 2.0 | 0.5 |
（4）诱导愈伤培养基
表4诱导愈伤培养基
| 编号 | 培养基 | 6-BA（mg·L-1） | NAA（mg·L-1） |
| 1 1 | MS | 1.0 | 0.1 |
| 2 | MS | 1.0 | 0.2 |
| 3 | MS | 1.0 | 0.5 |
| 4 | MS | 1.5 | 0.1 |
| 5 | MS | 1.5 | 0.2 |
| 6 | MS | 1.5 | 0.5 |
| 7 | MS | 2.0 | 0.1 |
| 8 | MS | 2.0 | 0.2 |
| 9 | MS | 2.0 | 0.5 |
（5）继代增殖培养基
表5继代增殖培养基
| 编号 | 培养基 | 6-BA（mg·L-1） | NAA（mg·L-1） |
| 1 1 | MS | 1.0 | 0.2 |
| 2 | MS | 1.0 | 0.5 |
| 3 | MS | 1.0 | 0.1 |
| 4 | MS | 1.5 | 0.2 |
| 5 | MS | 1.5 | 0.5 |
| 6 | MS | 1.5 | 0.5 |
| 7 | MS | 2.0 | 1.0 |
| 8 | MS | 2.0 | 1.0 |
| 9 | MS | 2.0 | 1.0 |
（6）生根培养基
表6生根培养基
| 编号 | 培养基 | NAA（mg·L-1） | IBA（mg·L-1） |
| 1 1 | MS | 0.1 | 0.0 |
| 2 | MS | 0.2 | 0.0 |
| 3 | MS | 0.5 | 0.0 |
| 4 | MS | 0.0 | 0.1 |
| 5 | MS | 0.0 | 0.2 |
| 6 | MS | 0.0 | 0.5 |
| 7 | MS | 0.1 | 0.1 |
| 8 | MS | 0.2 | 0.2 |
| 9 | MS | 0.5 | 0.5 |
（7）多倍体诱导方案
表5不同浓度秋水仙素溶液诱导多倍体
| 编号 | 外植体 | 秋水仙素浓度（） | 浸泡处理时间（h） |
| 1 | 顶芽 | 0.10 | 12 |
| 2 | 顶芽 | 0.25 | 24 |
| 3 | 顶芽 | 0.50 | 36 |
| 4 | 顶芽 | 0.50 | 48 |
| 5 | 不定芽 | 0.10 | 12 |
| 6 | 不定芽 | 0.25 | 24 |
| 7 | 不定芽 | 0.50 | 36 |
| 8 | 不定芽 | 1.0 | 48 |
2.技术路线
3.实验方案
（1）实验材料
菘蓝种子
（2）消毒方案的筛选
将挑选出的菘蓝种子用洗衣粉洗净，再将其放在自来水管下冲洗20-30min。然后将种子放在滤纸上吸干表面的水，再放在超净工作台上，开启紫外通风灭菌。用 75酒精和0.1次氯酸钠对外植体进行灭菌处理，处理时间分别为30S、8min，30S、10min，30S、12min，用无菌水涮4-5次后，再用滤纸吸干水，接种到MS培养基上，每瓶接种4-6粒种子，一周后观察。比较不同消毒方案下菘蓝种子的污染情况，以此选出最佳消毒方案。
（3）发芽培养基的筛选
本实验选取MS为基本培养基，每升培养基加入蔗糖30g、琼脂7g，将pH调成5.8。将配好的培养基平均装入培养瓶中，放进121℃的灭菌锅中灭40min后取出待用。种子实验的培养基是选用不同浓度NAA（0、0.2、0.3、0.5mg/L）和6-BA（1、3mg/L）配比的4种MS培养基。接入种子一周之后观察种子发芽情况并统计结果。
（4）菘蓝下胚轴和子叶的诱导
在获得菘蓝的无菌实生苗后，为了建立菘蓝的再生体系，本实验生长素选择了NAA，细胞分裂素选择了6-BA，其价格低廉，且效果较好,因此选择这两种激素来筛选出适宜菘蓝生产的最佳培养基。本实验以MS作为基本培养基，每升培养基加入蔗糖30g，琼脂7.5g，培养基中分别加入6-BA0.0、0.5、1.0、2.0mg/L，NAA0.0、0.1、0.2、0.5mg/L，共设计8种处理组合，以此筛选出最适宜的激素配比。选取菘蓝的下胚轴与子叶作为外植体，并将它们切成0.5-1.0cm左右的小块，然后将它们接入不同激素组合的培养基中，其中每种培养基接种10瓶，每瓶接种4个外植体，而后放入温度为25℃的光培室进行培养，光照12-14h/d，光照强度1500-2000Lx。
（5）愈伤组织诱导
本实验生长素选择了NAA，细胞分裂素选择了6-BA，来进行菘蓝生产的最适培养基的筛选。本实验以MS作为基本培养基，每升加入30g蔗糖，7g琼脂，将ph调成5.8，培养基中分别附加6-BA1.0、1.5、2.0mg/L；NAA 0.1、0.2、0.5mg/L，进行最适激素配比的筛选。实验过程中选取菘蓝无菌苗的叶片和叶柄作为外植体，将其切成0.5-1.0cm左右的小块，共设计9种处理组合，其中每种培养基接种10瓶，每瓶接种4个外植体，放入25℃的组培室，光照12-14h/d，光照强度1500-2000Lx。
（6）继代增殖培养
在上一步诱导出愈伤组织的基础上，本实验设计了以MS为基础培养基，附加不同浓度的6-BA1.0、1.5、2.0mg/L和NAA0.2、0.5、1.0mg/L，进行最适继代培养基的筛选。将它们接入具有不同激素水平的培养基后，放入 25℃组培室中培养，光照12-14h/d，光照强度1500-2000Lx。30d后观察其增殖情况并进行统计记录，得出最佳继代培养基。
（7）试管苗生根
挑选发育良好的约3-5cm高的试管苗，转移至生根培养基上进行不定根的诱导。本实验选取MS为生根培养基的基本培养基，添加不同浓度的NAA0.0、0.1、0.2、0.5 mg/L，和IBA0.0、0.1、0.2、0.5mg/L，共设计16种处理组合，其中每种培养基接种15瓶，每瓶接种 3个外植体，放入温度25℃的组培室。培养20d后观察生根情况并统计生根率。
（8）多倍体诱导
以种子萌发的幼芽为外植体进行菘蓝的多倍体诱导，本实验选取菘蓝种子萌发的顶芽和愈伤组织形成的不定芽为外植体，分别用浓度为0.1、0.25、0.5、1的秋水仙素溶液处理12h、24h、36h、48h，每组取幼芽30株，分别统计成活率。
4.可行性分析
（1）本试验研究目的明确，实验设计合理且条理清晰，具有很强的针对性。
（2）本试验所涉及的实验方法成熟，具有很强的可操作性，且实验所涉及的仪器试剂已具备。
（3）本试验所需实验材料菘蓝种子已由实验室提供。
（4）指导教师汤兴利有丰富的相关研究经验，能给予我们所需的指导，尽量避免实验过程中的失误。
因此本试验可行性高。
4. 研究创新点
四．特色或创新之处
（1）材料创新
经过在cnki的系统检索，未见关于药用植物菘蓝以顶芽诱导同源四倍体种质的报道。
5. 研究计划与进展
五．研究计划及预期进展
| 计划时间 | 预期进展 |
| 2019年2月-2019年3月 | 外植体消毒和无菌系的建立，确定外植体消毒的合理方案 |
| 2019年3月-2019年4月 | 种子发芽、分化、诱导愈伤、继代增殖和生根培养基的优化筛选，确定最佳培养基 |
| 2019年3月-2019年4月 | 利用秋水仙素诱导多倍体并统计成活率 |
| 2019年4月-2019年5月 | 实验数据整理，论文撰写 |
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