1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
胚胎的冷冻保存是胚胎生物技术的重要组成部分，不仅可以为体外受精、核移植、胚胎移植等胚胎工程技术提供具有发育能力的材料，也可以与精液冷冻保存一起建立种质资源库，为有价值的雌性个体和珍稀濒危野生动物的遗传资源的长期保存提供新的途径[1]。猪胚胎的保存对于增加高质量遗传资源的高效利用，阻止疾病通过动物传播以及降低猪的运输成本具有重要意义[2]。猪的胚胎由于胚胎脂质含量较高等原因，冷冻保存技术难度大，相对其它家畜牛、羊等一直进展较为缓慢[3]。在过去的几年中，玻璃化冷冻在人和动物胚胎学领域，已经被认为是可替代传统慢速冷冻一种非常有效的方法。具有简便，快速，经济，避免细胞内外冰晶形成的优点。cryotop是当前使用最广泛的玻璃化冷冻方式之一[4][5]。然而，与其他物种卵母细胞的玻璃化冷冻相比，猪卵母细胞由于大量脂肪颗粒的原因，对低温极其敏感[6]。尽管很多研究者将多套玻璃化冷冻程序应用于猪卵母细胞的玻璃化冷冻中，但冻融后细胞的存活率仍不尽人意，而且后续发育潜能受到严重破坏[7]。
影响卵母细胞冷冻效果的因素众多，其中一个主要因素就是卵母细胞的发育阶段。卵母细胞在从gv期到mii期的成熟发育过程中，要发生一系列的变化。冷冻保存gv期卵母细胞常常导致细胞器、卵黄膜和颗粒细胞联系的中断,直接影响体外成熟、受精与后期发育。成熟卵母细胞处于减数分裂的mii期，由于体积大,含水分多及染色体排列在纺锤体的赤道板上等原因，在冷冻复苏过程中极易受到细胞内冰晶形成所造成的损伤,尤其是微管系统对热很敏感，在冷冻复苏过程中容易发生解聚[3]。多数研究结果表明卵母细胞对冷冻的耐受性随发育的增加而增加，mii期卵母细胞的冷冻效果明显优于gv(生发泡期)和 gvbd(生发泡破裂期)卵母细胞[8]。卵母细胞对冷冻的耐受性随着发育的增加而增加，可能是由于随着发育的进行，卵母细胞膜对水分和冷冻保护剂的通透性发生变化所引起。这种不同发育阶段膜的特征性变化，使成熟卵母细胞比未成熟卵母细胞更易达到所需冷冻保护剂的浓度[3][8]。但另一方面，也有报道gv期卵母细胞更适合冷冻保存，对马卵母细胞玻璃化冷冻的实验中也发现gv期卵母细胞比mii期卵母细胞获得了更高的纺锤体形态正常率和发育能力，并证明gv期卵母细胞卵丘细胞紧密包裹有助于获得更高的纺锤体完整率[8]。冷冻猪gv期卵母细胞的存活率虽然较低，但却能够正常完成减数分裂恢复，其体外受精能力也未受影响，并且可以产生高质量的囊胚。随着猪gv期卵母细胞的冷冻保存技术不断优化和完善，其存活率大幅提高，使得在此阶段进行冷冻保存具有更大的潜力[6]。
虽然通过技术的改进，哺乳动物卵母细胞的玻璃化冷冻研究己取得了相当大的研究进展，但是效果仍不理想。尤其在玻璃化冷冻对低温特别敏感的猪卵母细胞冷冻时，虽然在冷冻程序上进行了一些改进，但所获得的存活率仍偏低，受精后的发育力更低。因此要进一步提高卵母细胞玻璃化冷冻效果，还需对玻璃化冷冻进一步优化。
2. 研究的基本内容和问题
目标：通过比较猪gv期卵母细胞和mii期卵母细胞cryotop冷冻复苏的成活率，选择猪卵母细胞玻璃化冷冻的最佳时期。
内容：
1.猪gv期卵母细胞的采集，培养
3. 研究的方法与方案
1.研究方法：
通过对猪gv期和mii期的卵母细胞进行cryotop玻璃化冷冻及复苏，计算各自的成活率和成熟率。通过比较两个时期卵母细胞的冷冻效果，猪胚胎冷冻保存技术的优化提供参考依据。
4. 研究创新点
由于玻璃化冷冻保存还处于研究阶段，不同的细胞采用不同的冷冻方法、不同的冷冻保护剂,处理方法对细胞的冷冻效果差异较大。同时对GV期和MII期猪卵的cryotop冷冻研究较少，本实验使用了新的冷冻方法来对这两个时期的猪卵进行冷冻和解冻，为猪卵的冷冻保存的优化完善提供了的数据。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2019.04 —— 2019.05 进行实验
2019.05 —— 2019.06 数据处理，撰写论文
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