草食动物厌氧真菌菌群结构分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

自从1975年orpin发现了瘤胃厌氧真菌，经过40多年的研究，迄今为止，人们己在许多反刍动物及单胃草食动物的消化道和粪样中分离到多种厌氧真菌，共计六个属十余种之多，并对其进行了分类、鉴定，对其生态学有了较为深入的研究。厌氧真菌是瘤胃内重要的纤维降解菌之一，占总瘤胃微生物的8%～20%(orpin等，1997；williams 等，1997；rezaeian 等，2004 )。厌氧真菌对植物粗纤维的降解可分为两步，第一步为厌氧真菌假根深入到植物组织的细胞间隙和细胞壁内，将植物组织破解为小碎片利用其自身及其他纤维降解微生物利用，第二步为厌氧真菌分泌大量纤维降解酶对植物细胞壁进行降解。厌氧真菌能产生广泛的降解纤维素酶，主要包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、酯酶、果胶酶、半乳糖醛酸酶等13种,这些酶可以降解植物细胞壁中碳水化合物的主要结构( wood等，1986a )，并可在真菌的孢子核营养阶段释放，作用于大分子像纤维素、半纤维素来获得营养物质来生长( lowe等，1987；mountfor等，1985；william等，1987 )。neocallimastix frontalis产生的纤维素酶能快速降解晶体状纤维素，有时其降解速度甚至大于商业菌株里氏木霉和嗜松青霉( penicillium pinophilum )( wilson等,1992 ; wood等, 1986b)。瘤胃厌氧真菌产生的木聚糖酶比起瘤胃细菌，不仅产生速度快、活性高，且瘤胃厌氧真菌产生的木聚糖酶活性在体外培养48h后是细菌的1.5倍,是原虫的5倍,是自然状态下瘤胃液的1.4倍,随着时间的延长到96h时,与自然瘤胃液趋于一致,但仍然超出细菌和原虫(lee等,2000)。近年来，研究者们一致认为瘤胃真菌能产生 α － 淀粉酶及淀粉葡萄糖苷酶，并都可利用淀粉和麦芽糖为底物，但哪一种酶在降解淀粉中起主要作用及降解产物方面还存在分歧( william 等,1987 ; mounrfort等, 1989 )。

目前,人们从n .forntalis中提取出了这两种酶,并检测出其中α -淀粉酶在体外降解底物的最适ph 为5.3,最适温度为55℃,最有效的底物为淀粉和麦芽糖。michel等(1993)发现有7种瘤胃真菌(分别属于4个属:orpinomyces caecomyces piromyces 和neocallimastix )可以产生蛋白酶可以产生蛋白酶，这7种瘤胃真菌分泌的蛋白酶都有氨基酶活性，其中2种还有肽链酶的活性但无羧肽酶活性。蛋白酶抑制剂如ed-ta、1，10-邻二氮菲等可抑制这些蛋白酶的活性，抑制程度可达50%~70%。毛胜勇等(2002)首次通过活体动物试验去除厌氧真菌后，结果发现微生物蛋白质浓度显著上升，瘤胃内nh3-n浓度显著下降，而nh3-n是反映氮代谢的重要指标，这反映了瘤胃真菌在蛋白质的利用上可能有着重要作用。

大量研究已经证明，虽然厌氧真菌在瘤胃中栖息数量少于细菌和原虫，但其降解粗纤维的能力远远高于细菌和原虫。鉴于厌氧真菌培养本身存在的技术难度，有关瘤胃厌氧真菌分类及多样性方面的研究报道仍十分有限。目前对瘤胃厌氧真菌的研究从最初的形态鉴定、分类到近几年利用分子生物学技术研究瘤胃真菌的多样性，对瘤胃厌氧真菌的研究逐渐深入。到目前为止，共发现的瘤胃厌氧真菌有6个属19种之多,且瘤胃厌氧真菌的种类还在不断增多 stamatakis (2006)发现4个新的属, 寄居部位也从最初的瘤胃拓展到非瘤胃草食动物的肠道 liggenstoffer等(2010)选取了分属于10个科的33种不同动物的粪便,扩增厌氧真菌的its1 ,获得可用序列 267287个，并构建系统进化树，结果发现占全体序列38.3%的序列不属于已知6个属中的任何一个,系统发育学分析得出8个新的真菌类别(ng1~ng8) 。由此可见，因瘤胃复杂的环境，及厌氧微生物培养的苟刻条件，使得瘤胃微生态研究的进展缓慢。特别是真菌方面的研究更为少见。因此，有必要分析厌氧真菌菌群多样性与结构，为研究瘤胃真菌种属间进化发育的距离和分类，和了解厌氧真菌对反刍动物瘤胃甲烷排放的贡献，提高反刍动物饲料利用率提供基础。并能更好地揭示厌氧真菌在瘤胃中的分布和功能，为今后科学合理地开发和利用瘤胃微生物资源提供应用基础研究依据。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

分析草食动物厌氧真菌菌群多态性，同时，比较分析反刍动物与非反刍动物、粪便与瘤胃内容物中厌氧真菌菌群结构差异，探析草食动物厌氧真菌菌群结构特征。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

技术路线

请在附件中查看。

4. 研究创新点

分析草食动物厌氧真菌菌群结构，并比较反刍动物与非反刍动物、粪便与瘤胃内容物间厌氧真菌菌群结构的差异。

5. 研究计划与进展

2016.7-2016.9 前期准备与资料收集

2016.9-2017.3 从数据库中提取数据，分析，整理，讨论。

2017.3-2017.5 论文写作，准备答辩