日粮麸皮替代水平对二花脸猪肠道大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌丰度的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

我国作为世界第一养猪大国，面临着市场价起伏不定但成本居高不下的问题。在养猪成本中，饲料成本要占到70%以上，饲料资源的缺口暴露地越来越明显，精料的来源少、成本高，难以保证精料的供给。提高饲料中纤维类物质的利用率，不但可以提高猪的生产性能、减少排泄物，而且可以提高农作物的资源利用效率，缓解农业资源的供需矛盾^[1]。猪对粗饲料的消化能力因品种和年龄不同而有所差异，中国地方猪种如梅山猪^[4-6]、淮猪^[7-9]等，对高纤维水平日粮表现出更强的粗纤维消化能力^[4-6]，研究中国地方品种猪耐粗饲性状具有重要的理论和实践意义。二花脸猪是我国重要地方猪种之一，肉质优良，繁殖性能好，有良好的耐粗饲性能。经过前期研究发现，与大白猪相比二花脸猪更耐粗饲，能充分利用糠麸、糟渣、红薯藤等农副产品，在较低的营养水平及低蛋白质情况下获得增重。因此二花脸猪非常适合作为本实验的实验对象，本试验研究日粮麸皮替代水平对二花脸猪肠道微生物的影响。

肠道微生物主要分布在肠腔内流动食糜中，且黏附于肠道黏膜及相关的黏膜层，发挥营养物质代谢调控、肠道上皮细胞修复、肠道黏膜免疫激活、宿主行为调控、抵抗病原微生物等重要作用^[10]。而已有研究发现膳食纤维有利于诱导肠道菌群中的好气性微生物的生长，抑制厌氧菌的生长和繁殖，改善肠道菌群比例，可增加肠道中有益菌群如双歧杆菌等的优势^[11]。目前，国内外对粗饲料对猪肠道微生物的影响做了一定研究。张永婧等^[12]研究表明，饲粮中增加小麦麸能够显著提高生长猪回肠食糜中普氏菌属和乳酸杆菌的数量，而大豆皮则会增加回肠食糜中瘤胃球菌属及粪便中拟杆菌属、毛螺菌属的相对丰度，各纤维组日粮均可显著提高猪肠道内非淀粉多糖降解菌的丰度。metzler-zebeli等^[13]研究表明饲粮中增加高黏度低发酵性的羧甲基纤维素钠(cmc)与添加高发酵性能的β-葡聚糖相比能够显著增加肠道内总细菌、拟杆菌属、肠球菌属、梭菌属的数量。张叶秋等^[14]用米糠饲喂苏淮猪，试验第14天米糠组羧甲基纤维素酶活性极显著升高，黄色瘤胃球菌数量增加，乳酸杆菌和双歧杆菌数量在试验第28天均显著增加，柔嫩梭菌数量在试验结束时显著升高，而白色瘤胃球菌在整个试验期均无显著变化。冯平^[15]用麸皮、大豆皮和玉米皮的3种日粮饲喂育肥猪，发现在3个试验组猪粪便中乳酸杆菌、白色瘤胃球菌、拟杆菌、普氏菌、产琥珀酸丝状杆菌的数量均随饲喂时间的延长均发生了变化。

而目前二花脸猪对高纤维日粮消化过程中发生的微生物的响应变化尚缺乏系统研究，本实验能为此提供相关的基础数据。本实验可以进一步探究二花脸猪的耐粗饲性能，为选择对提高猪肠道健康有利的日粮纤维水平提供依据，为科学合理利用日粮纤维提高猪只抵抗力、保护肠道健康提供理论基础。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

将二花脸猪随机分为三个日粮麸皮替代水平组，通过研究其有益菌种乳酸杆菌、双歧杆菌和有害菌大肠杆菌的数量，以找出最有利于二花脸猪肠道健康的麸皮替代水平。

3. 研究的方法与方案

研究方法和试验方案

1.试验动物：本试验选择择约 40 kg 二花脸育肥阉公猪作为试验动物，共15头。

2.试验日粮：本试验基础日粮配制参考中国《猪饲养标准(NY/T 65-2004)》肉脂型生长肥育猪标准制定，委托安佑生物科技集团股份有限公司生产。各组日粮间除纤维水平不同外，其他代谢能、粗蛋白、粗脂肪、总磷、总钙、赖氨酸、蛋氨酸 胱氨酸等均保持同一水平。所有日粮纤维、粗蛋白、粗脂肪等指标含量均按照中华人民共和国国家标准饲料分析法和美国分析化学家协会 AOAC(Association ofOfficial Analytical Chemists)方法进行分析。日粮配方及营养水平具体信息见表 1-1。

表1-1日粮配方及营养水平

3.试验分组和日粮管理：试验饲养过程在南京农业大学淮安研究院试验猪场完成，屠宰在淮安苏食肉品有限公司进行，整个饲养过程预饲期10天，正试期28天，所有试验猪全天自由采食、自由饮水。在试验开始前10天预饲期至正式试验第0天时，所有猪饲喂相同基础日粮；正试期开始后设3个纤维水平处理组，分别饲喂基础日粮、7%麸皮替代基础日粮和14%麸皮替代基础日粮；因采用奥饲本FIRE全自动生产性能测定系统，每个处理5个重复，每个重复1头猪，至正试期第28天，每个猪组每个处理屠宰5头。

4.试验方案

1) 采样

(1)采样地点：江苏省淮安苏食肉品有限公司

(2)采样前准备

试剂：75%酒精、生理盐水、干冰、液氮。

器材准备：手术刀柄、刀片、手术剪(大、小)、镊子、记录笔、记号笔、乳胶手套、PE手套、冰袋(提前冷冻)、液氮罐、保鲜膜、一次性水杯、抽纸、吸水纸、桌布、垃圾袋、酒精喷壶、屠宰刀具、实验服、口罩、标签、创口贴、泡沫箱、2 mL灭菌冻存管。

(3)样品采集

猪电击宰杀后，快速打开腹腔，分离出肠道。无菌操作，分别在空肠中点、盲肠、结肠中点肠面处豁开一小口，收集内容物于2 mL灭菌冻存管，迅速保存于液氮中，用于总菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌数量的测定。

2)肠道细菌数量的测定

(1)主要试剂及仪器

试剂：胰蛋白胨，酵母浸出物，氯化钠，琼脂粉，氨苄青霉素，Tris，硼酸Na₂EDTA·2H₂O，GoldView核酸染色剂等。

仪器: 梯度 PCR扩增仪，实时荧光定量 PCR仪，低温高速离心机，凝胶成像仪，可调式微量移液器，紫外分光度计，微量分光度计，电子天平，恒公温磁力搅拌器，上海沪西分析仪厂，高压消毒锅，温磁力搅拌器，超净工作台，气相色谱仪。

(2)样品中DNA提取

1. 添加500 mg的样品到Lysing MatrixE Tube。

由于FastPrep仪器的移动，在管内看到大量的聚集。相同LysingMatrix不应超 过管的体积的7/8。留在管的空间，也提高了更好的同质化的机会。

裂解:加入978 μL Sodium Phosphate Buffer和122 μL MT Buffer。

2. 在FastPrep⑧仪器中混匀40秒的速度6.0。

3. 14000×g离心Lysing MatrixE Tubes 5-10分钟。

4. 上清转移到一个2 mL干净的管。加入250 μL PPS试剂和混合，用手摇动管的10次。

5. 14000×g离心5分钟沉淀沉淀。上清转移到一个干净的15毫升管。上清液加入1 mLBindingMatrixSuspension。(BindingMatrix在用前重悬均匀)

6. 放在一个旋转器或手工反转2分钟，让DNA结合基质。将管放架上静置3分钟，让硅胶基质沉淀。

7. 小心去除500 μL上清,避免碰到沉淀的BindingMatrix。弃上清。重悬BindingMatrix在剩余的液体中。约600 μL的混合物转移到SPINFiter,14000×g离心1分钟。倒空Catch Tube,并把剩下的上清加到SPINFilter中离心过滤。

8.添加500 μL SEWS-M到SPINFilter,离心1分钟，在14000×g。倒出流过液并把SPINFilter放回Catch Tube，14000×g离心2分钟,在清干SPIN Filter中的剩余SEWS-M。

9.移动SPINTM Filter到新的Catch Tube,室温下风干5分钟。

10.加入50-100 μL DES轻轻的重悬，轻轻搅动滤膜用枪头或涡流/手指轻弹，重悬为高效的DNA洗脱二氧化硅矩阵。在14000×g离心1分钟，转移洗脱的DNA到Catch Tube。

1.(3)DNA电泳检测

上步提取完毕的DNA再经1.2%琼脂糖凝胶电泳，检验提取质量及完整性。

(4)细菌标准品制备

①引物设计与验证

表1 定量PCR引物

通过 PCR 进行各个引物的验证，并摸索最佳退火温度，PCR 体系为20 L。反应以 60℃为中心温度，摸索范围为 55-65℃，PCR 扩增反应体系反应条件如下：

98℃ 2 min

98℃ 10 sec

40 循环

Tm 5℃ 10 sec

72℃1 min

72℃2 min

4℃ ∞

②保守区域片段的 PCR 扩增

凝胶电泳验证后的引物进行 PCR 扩增，反应程序同上步。

③PCR 产物回收纯化

利用PCR产物纯化试剂盒回收PCR 产物。

④T Vector 载体连接与目的片断的克隆

纯化的 PCR 产物与 PMD19-T Vector 载体连接，连接反应体系为 10 L，其中pMD18-T Vector 1 L，Insert DNA 4 L 以及 Ligation Mix 5 L，16℃过夜。

⑤转化

1) 取出冻存的感受态DH5α放置于冰盒中让其缓慢融化。

2) 向感受态悬液中加入适量的克隆载体，充分混匀后，冰浴30 min左右。

3) 将离心管放置于42℃水浴锅中进行热刺激60-90 s，然后迅速取出放到冰盒中。

4) 静止2-3 min后，向离心管中加入900 L SOC 培养基或者是LB液体无抗培养基，混匀后于37℃摇床振荡45 min左右。

5) 从吸取10 L 混液滴加到含有氨苄抗性的LB固体培养平板上并涂匀，然后将平板放置于培养箱中，37℃条件下培24 h，涂板后大约培养24 h左右便可见菌斑。

⑥重组质粒细菌扩培

将含有氨苄的 LB 液体培养基倒15 mL离心管，用紫外灭菌的白枪头挑取大小适中，圆状旁边无杂质的菌斑，与白枪头一起放入离心管中，后将离心管放置于 37℃摇床上震荡直到液体变浑浊即可。

⑦目标片段的测序与序列比对

为了验证重组的成功与否，挑选2个阳性克隆混液送去公司进行测序，在 NCBI上进行序列的同源性分析，对比结果显示与原菌株同源性大于99%，则表示克隆成功。

⑧重组质粒 DNA 提取

使用无内毒质粒DNA小量提取试剂盒进行含有目的片段的重组质粒DNA的提取，用做参比模板。

1)收集 1-4 mL 过夜培养的 LB 液体，13400× g离心1-2 min，以收集菌体。

2)加入 250 L buffer S1(使用前确认已加 RNase)，振荡均匀，彻底重悬菌体。

3)加入 250 L buffer S2，轻轻混匀4-6次，避免剧烈振荡，室温孵育5 min 以内。

4)加入 400 L buffer S3，轻轻混匀6-8下，此时会出现白色絮状沉淀，13400×g 离心l0 min。

5) 将吸附柱移入新的2 mL的离心管中，将上步上清液转移到吸附柱中，13400×g离心l min。

6) 吸附柱中加入500 L buffer W1，13400×g 离心l min，弃废液。

7) 吸附柱中加入700 L buffer W2，13400×g 离心l min，弃废液。

8) 重复上步。

9) 弃去滤液，13400×g离心l min，晾干。

10) 将吸附柱放入1.5 mL离心管中，洗脱 DNA，加入60-80 L洗脱液(65℃预热)，加在离心柱中心，室温放置1 min，13400×g 离心l min(可重复一次，增加洗脱效率)。

(5)各目标菌含量标准曲线制定

利用ABI 7300 Real-time PCR仪对样品中相关细菌数量进行定量分析，并制作标准曲线。标准曲线以拷贝数对数为横坐标(X)，CT值为纵坐标(Y)。将标准质粒DNA 按照 10^-2-10^-6 连续5个浓度梯度稀释，以此为模版，根据各目标菌引物，在PCR仪上进行扩增，PCR反应体系和反应条件如下：

95℃ 30 sec

95℃ 5 sec

60℃31 sec

95℃ 15 sec

60℃1 min

95℃15 sec

(6)各目标菌含量检测

以粪便DNA为模版，对每个样品中目标菌进行扩增，根据标准曲线计算各样品中目标菌的丰度差异。定量PCR反应体系同上步，反应程序同上步。

细菌的丰度和Ct值之间的计算公式如下：

Copies/g = (6.02×10²³)×(C×10^-9) / (A×660)

其中 C：DNA 浓度(ng/μL)，A：目的片段长度(bp)。

4. 研究创新点

(1)目前针对二花脸猪在饲喂高纤维麸皮日粮时其肠道菌群方面做出的适应性变化的研究比较缺乏，本试验就这一方向进行研究，可以为探究二花脸猪合理的脱脂米糠添加水平提供一定的理论依据。

(2)本论文采用麸皮替代部分日粮进行二花脸猪饲养试验，在充分开拓本土饲料资源的同时节省生产成本，为二花脸猪品种推广以及为低价日粮配方的制定提供理论指导。

5. 研究计划与进展

选题时间：2018年6月

综述时间：2018年7月

试验开始时间：2018年10月