鹅KIAA1462基因SNP检测及其与产蛋性状关联分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

本研究将应用等位基因特异pcr技术，根据鹅kiaa1462基因的snp（a→t）来挖掘鹅产蛋性能相关的snp标记，并验证kiaa1462基因与鹅产蛋性能的相关性，为鹅产蛋性能的提高提供技术支持。

kiaa1462基因是kiaa基因家族的成员，目前相关研究较少。它是通过简化基因组测序技术（rad-sequencing）筛选产蛋性能候选snp，发现的一个与鹅产蛋性能相关的功能基因。kiaa基因家族数据库中关于该基因的相关内容主要是关于已克隆的kiaa基因的序列特征。首先是已克隆的kiaa基因cdna物理图谱，随后是预编码蛋白质区和genemark-rc分析的结果绘制图连接^[1]。数据库中关于kiaa基因的分类将新鉴定分离的基因及其预编码的蛋白质按照现有的已知蛋白质或是蛋白结构域的某些相关功能分为六类：1、与细胞信号和细胞间信息传递相关的蛋白质。2、与核酸合成和调控相关的蛋白质(nucleicacidmanaging)：例如转录因子、解旋酶和剪接因子。3、与蛋白质合成相关的蛋白质(proteinmanaging)：例如修饰和降解所需要的酶类。4、与细胞结构和运动相关的蛋白质(cellstructure/motility)：例如细胞骨架蛋白质、膜骨架蛋白质、细胞外矩阵、马达蛋白。5、与细胞分裂相关的蛋白质。6、与细胞新陈代谢相关的蛋白质，此外还包括未分类的和无线索的^[2]。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

研究目标：

鹅kiaa1462基因snp检测及其与产蛋性状关联分析。

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1 研究方法

本项目拟采取的主要方法包括：试验样品的采集，DNA提取，AS-PCR分型。

3 实验方案

3.1首先进行鹅血样的的采集

将10ml的玻璃瓶及塑胶盖洗净灭菌，静脉抽取鹅血液放入小瓶中（小瓶内事先加入肝素钠抗凝），注意在采集鹅血的时候要尽量减少污染，动作应迅速。

3.2鹅血样中DNA的提取:

⑴用灭菌的1ml枪头从小瓶中吸取500μl血样，放入1.5ml的EP管里。

⑵向管内加445μl 1SET、25μl蛋白酶K（10mg/ml）、25μlSDS（10%），混匀。

⑶55℃空气浴振荡过夜。

⑷加500μl Tris饱合酚，上下颠倒10min。

⑸12000rpm离心10min，小心吸取上层水相于新的EP管中。注意不要触到、吸入中层蛋白质，其严重影响DNA的质量和后续反应。

⑹在吸得的上层水相中加入等体积酚、氯仿、异戊醇（24：23：1）混合液，上下颠倒10min。

⑺12000rpm离心10min，小心吸取上层水相于新的EP管中。

⑻加入等体积氯仿、异戊醇（23：1）混合液，上下颠倒10min。

⑼10000rpm离心10min，小心吸取上层水相于新的EP管中。

⑽加2倍体积无水乙醇（-20℃预冷），横向振荡3min。

⑾10000rpm离心10min，管底可见白色DNA沉淀。

⑿加1ml70%乙醇悬浮、洗涤DNA沉淀。

⒀8000rpm离心5min，倒掉乙醇，将EP管倒置在滤纸上直至管中的乙醇完全挥发。

⒁加100μl TE缓冲液，置55℃水浴中至DNA完全溶解。

⒂进行基因组DNA的浓度测定和质量检测。

3.3 AS-PCR体系与程序

等位基因特异PCR ( Allele-pecific PCR ,AS-PCR),其基本原理是：根据SNP位点设计特异引物，其中两条链 (特异链)的3′末端与SNP位点的碱基互补(或相同)，另一条链(普通链)按常规方法进行设计，因此，AS -PCR 技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物，在另一种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定基因型的SNP。AS-PCR 技术的基本原理如图1：等位基因1(Al和等位基因2除SNP( T-C )位点外其他序列完全相同，引物P1、P2分别为根据等位基因1的SNP位点( T )和等位基因2的SNP位点（C）设计的特异引物 (图 1A)。以基因型 1 ( Genotype 1) 为模板，分别用引物P1和P2进行扩增，因为P1特异链的3′末端刚好与基因型1的SNP位点T互补，所以能够产生扩增产物，P2 特异链的 3′末端与基因型1的SNP位点T不互补，所以没有扩增产物，因此基因型1是纯合型 T/T；同样基因型2( Genotype 2)是纯合型 C/C；以基因型3( Genotype 3)是杂合型 T/C(图1B)。根据凝胶电泳中有无带型就可以确定基因型的SNP（图1C）。

图1 AS-PCR原理图

步骤：

（1）设计两条正向引物P1、P2，其3′末端与SNP位点的碱基互补（P1）或相同（P2)，3′端倒数第三个碱基更改为错配碱基，即序列中若为A，引物中可以更改为G,C，T。设计一条反向引物p3。为了选择出最好的引物，每次可以合成三组引物以供选择。

（2）PCR扩增体系

（3）PCR扩增程序

（4）琼脂糖凝胶电泳检测

扩增后取全部PCR产物用合适大小的琼脂糖凝胶进行电泳检测，130V电压下电泳约30min。

4.可行性分析

本研究所采用的技术都是本课题组常用的实验技术，能保障实验内容的顺利完成。另外，本实验室仪器设备和试剂齐全，能保障实验的顺利进行。

4. 研究创新点

特色或创新之处

KIAA1462基因在鹅上的研究少，其功能有待进一步研究，本研究将为KIAA1462基因功能的研究提供理论基础，为鹅的分子生物学选育提供标记。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

2015.4-2015.6 snp基因分型相关文献的查阅

2015.7-2015.8 鹅血样采集，dna提取