猪CTSS基因SNP检测及其与肉质性状关联分析开题报告

 2023-02-10 17:04:36

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、本课题的意义

现阶段，随着经济水平的不断发展，人民生活水平也在不断提高，消费者对猪肉的品质提出了越来越高的要求。肌内脂肪含量是影响猪肉品质的关键因素。猪肉肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）的含量与肉的品质密切相关，对肉的嫩度、多汁性和风味有明显的正效应[1]，特别是对肉的嫩度有显著影响[2]。肌内脂肪含量无法在活体进行直接测定，利用标记辅助选择技术可以实现对其的活体选育，而找到肌内脂肪含量的关键基因或紧密连锁标记是进行标记辅助选择的前提。单核苷酸多态性(SNPs) 作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆和遗传多样性的研究，SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性，通过在全基因组水平上筛选与肌内脂肪含量关联的SNPs，根据SNP在基因组中的位置以及连锁不平衡分析推测可能的候选基因，再对这些候选基因与肌内脂肪的关系进行验证和功能研究。CTSS基因属于cathepsin家族，即溶酶体组织蛋白酶家族。目前，大量的研究指出，cathepsin 家族对许多生理过程均具有调节作用，而该家族成员是通过分泌活性蛋白质来降解细胞外基质的某些组分，例如纤连蛋白、骨粘连蛋白来发挥作用。Cathepsin 家族的多名成员，例如CTSB 通过降解ECM 来影响血管的生成，被称作血管生成的开关[2-4]。CTSK、CTSS等均被报道与脂肪分化发育有关[5-8]。因此研究Cathepsin家族对于脂肪的影响对猪育种工作有重要意义。

二、国内外研究概况

候选基因是已知生物学功能和核酸序列的基因，它可以是结构基因或调节基因，也可以是在生化代谢过程中影响某一性状表达的基因。候选基因法研究主要包括以下步骤：①候选基因的筛选；②扩增基因的引物序列；③建立候选基因内的多态性分析和基因型分析方法；④试验群体的选择；⑤候选基因与表型性状间的连锁分析；⑥连锁关系的验证。

DNA分子标记可以弥补和克服其他遗传标记中的许多缺陷和难题，所以在短暂的几十年，分子标记技术得到了快速发展。至今已经有几十种分子标记相继出现，包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SNP、SSCP 等。

SNP包括单碱基的替换、插入与缺失等形式，而且其中最少有一种等位基因在群体中突变频率不小于1%。研究指出，SNP大部分是两等位性的。SNP是目前所有分子标记中多样性最丰富的标记。SNP位点在基因组中普遍存在，大约每l000bp就有一个碱基变异。SNP遗传稳定性高，并可以进行自动化分析。SNP也被称为继RFLP（限制片段长度多态性）、SSR（简单序列重复标记）之后的第三代分子标记。

1984年,日本学者Noumi等在对大肠杆菌进行酶切电泳实验时发现，长度相同的DNA片段即使单个碱基不同，利用非变性聚丙烯醜胺凝胶电泳进行检测时也能表现出差别。这种因为碱基序列的差异而表现出的多态现象被称为单链构象多态性。目前，该技术已经成为一种成熟的分子标记，并被广泛应用于生物学研究中。在猪肉质育种工作中PCR-SSCP技术已经成为一种快速高效实用的基因分型技术[3]。

组织蛋白酶属于溶酶体蛋白酶的酶家族。他们在许多类组织和细胞中具有广泛的功能。除了在蛋白质转换中的作用，它们还具有高特异性的蛋白水解活性，包括在肥胖病和肿瘤的发展中的免疫反应的抗原加工有直接的作用。目前，根据它们的结构和催化机理区分，已经命名了大约十几个此家庭的成员，其中包括：组织蛋白酶B（CTSB），D（CTSD），F（CTSF），H（CTSH）），K（CTSK）中，L（CTSL），S（CTSS），Z（CTSZ）和组织蛋白酶抑制剂（CSTB）（胱）等。尽管组织蛋白酶活性与组织蛋白基因多态性缺乏联系，但是在基因CTSD、CTSF、CTSH、CTSK和CTSZ等中有一些SNP位点多态性同意大利大白猪的肉产量和酮体性状有关[9-14]

三、应用前景

目前影响肌内脂肪含量的最主效基因还没有统一定论，因此对各种有可能影响肌内脂肪的基因的研究成为热点。本研究主要筛选与猪肌内脂肪含量相关的SNP，通过验证分析挖掘影响猪肌内脂肪沉积的功能基因，为猪肌内脂肪含量以及肉质性状做标记辅助选择，为分子育种工作提供理论和技术支持。

参考文献

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2. 研究的基本内容和问题

目标：研究猪CTSS基因多态性与肉质性状的关联。

内容：肌内脂肪含量是影响猪肉品质最关键的因素。肌内脂肪含量的提高能够很好改善猪肉的感观品质和食用品质，因此，提高肌内脂肪含量是改善猪肉品质的有效途径。肌内脂肪含量无法在活体进行直接测定，利用标记辅助选择技术可以实现对其的活体选育，而找到肌内脂肪含量的关键基因或紧密连锁标记是进行标记辅助选择的前提。单核苷酸多态性(SNPs) 作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆和遗传多样性的研究。本研究在前期通过SNP芯片在全基因组水平上筛查与肌内脂肪含量相关候选SNPs工作的基础上，采用PCR-SSCP技术进行基因分型，在大样本群体中验证候选SNP位点与肌内脂肪含量的关系，以期挖掘与肌内脂肪含量相关的遗传标记或候选基因。

拟解决的关键问题：

1、获得不同表型个体间有显著差异的SNP位点。

2、验证CTSS基因多态位点同猪肉质性状的关联性。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1、样品采集

2、提取DNA

3、表型指标测定

4、制备高低组DNA混池

5、SNP检测

5、用高低组混池筛选CTSS基因SNP

6、挑选SNP位点进行分型检测

7、结合表型数据进行关联分析

技术路线：

样品采集表型指标测定提取DNA在肌内脂肪含量高低组中验证SNP位点筛选SNP检测分析数据

实验方案：

1、基因组DNA提取

采用酚氯仿抽提法从猪背最长肌组织中提取基因组DNA，用紫外分光光度计估计含量。

(1)取约100mg背最长肌组织放于玻璃研磨器内，加1ml细胞裂解液，用玻璃匀浆器匀浆。

(2)匀浆液倒入2ml塑料离心管中，加20μl蛋白酶K，再加SDS至终浓度为1％，上下颠倒混匀。

(3)混合液置于55℃水浴过夜。

(4)水浴完毕后，向匀浆液中按1：1比例加酚/氯仿/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻震荡混匀5min，12000g离心5min。

(5)吸上层水相800μl于一灭菌塑料离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min，12000g离心5 min。

(6)吸上层水相500μl于一塑料离心管中，加入两倍体积的无水乙醇（乙醇事先经过-20℃预冷）

(7)12000g离心5min，沉淀DNA,倾去上清液。

(8)于沉淀中加入75%乙醇溶液500μl，轻轻混匀后12000g离心5min，倾去上清液，室温凉干。

(9)在管中加20ul的ddH2O水溶解，，-20℃保存备用。

(10) 用紫外分光光度计进行浓度测定。

2、制备DNA池

选择肌内脂肪含量极高和极低组各15个个体，每个个体的DNA模板按照其浓度添加相同的物质量混成高H组DNA池和低L组DNA池。

3、设计引物及PCR扩增

由NCBI查得CTSS基因序列，利用引物设计软件Primer5.0设计CTSS基因启动子区间引物。以期获得高低组有差异SNP。

4、对肌内脂肪高低组有差异SNP位点筛选。

PCR扩增CTSS启动子区间后进行测序，期望得到高低组有差异SNP位点。

5、对CTSS启动子区SNP位点用PCR-SSCP法进行基因分型。

主要采用PCR-SSCP方法进行SNP检测,聚丙烯酰胺凝胶,在1TBE电泳缓冲液(4 ℃) ,10V/ cm恒压条件下电泳15h,银染后用凝胶自动成像系统进行照相、分析。

6、分析CTSS基因在不同个体表达量与肌内脂肪含量的关系

7、单倍型分析

可行性分析：

单核苷酸多态性(SNPs) 作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆和遗传多样性的研究，SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性，通过在全基因组水平上筛选与肌内脂肪含量关联的SNPs，根据SNP在基因组中的位置以及连锁不平衡分析推测可能的候选基因，再对这些候选基因与肌内脂肪的关系进行验证和功能研究。

CTSS基因属于Cathepsin家族，即溶酶体组织蛋白酶家族。目前，大量的研究指出，cathepsin 家族对许多生理过程均具有调节作用，而该家族成员是通过分泌活性蛋白质来降解细胞外基质的某些组分，例如纤连蛋白、骨粘连蛋白来发挥作用。Cathepsin 家族的多名成员，例如CTSB 通过降解ECM 来影响血管的生成，被称作血管生成的开关。CTSK、CTSS等均被报道与脂肪分化发育有关。
本实验室对于相关实验已经建立起一套成熟的平台和方案，根据现有研究结论表明cathepsin家族在脂肪调控中具有重要作用，结合本实验室的研究结果，这种在脂肪调控中的作用很可能具有组织特异性，即CTSS基因很可能参与肌内脂肪沉积的某种组织特异性调控过程。而CTSS基因的多态性很可能影响不同猪个体的肌内脂肪含量。因此本课题具备成熟的前期理论基础。另外，本课题相关的样品、仪器和试剂在本实验室均已齐备。所以，本课题现已具有充足的理论基础和实验条件，可以顺利开展。

4. 研究创新点

特色或创新之处

1、肌内脂肪含量无法在活体进行直接测定，利用标记辅助选择技术可以实现对其的活体选育。

2、 PCR-SSCP技术已经成为一种成熟的分子标记，并被广泛应用于生物学研究中。在猪肉质育种工作中该技术已经成为一种快速高效实用的基因分型技术。

5. 研究计划与进展

研究计划：

2015年9月2015年12月：相关文献查阅，试验方法学习摸索，试验条件的准备。样品的采集及表型性状的测定。

2016年1月2016年3月：DNA提取及初步筛选SNP。

2016年4月2016年5月：验证SNP与肌内脂肪的相关性。

2016年5月2016年6月：结果整理和论文撰写。

预期进展：

熟练使用相关生物学软件，合理利用在线数据库资源，实验验证CTSS基因多态性同猪肉质性状的关联性，获得与猪肌内脂肪含量相关的阳性SNP和候选基因。

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