桔梗四倍体诱导与鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

桔梗[platycodongrandiflorum(jacq)a.dc.]为桔梗科(campanulaceae)桔梗属(platycodona.dc)多年生草本植物,药用部位为根。性味苦、辛平,归肺经,有开宣肺气,祛痰排脓之功效,临床上常用来治疗外感咳嗽,咽喉痛,肺痈吐痰,胸满肋病,痢疾腹痛等病症[1]。桔梗原产我国东北、华北、华东、华中各省以及广东、广西北部、贵州、云南东南部(蒙自、砚山、山)、四川(平武、凉山以东)、陕西等地。桔梗不仅是传统中药,也是我国东北区、日韩等东亚国家的常用蔬菜之一,是一种很好的功能性食品。此外,桔梗因其花型特殊,美观,也常用做观赏植物,故桔梗是一种集药用、食用和观赏于一体的重要药用植物。随着市场上对桔梗需求的不断增加，如何提高桔梗产量，优化桔梗育种已成为急需解决的问题。

多倍体育种是中药材良种培育的一个重要途径,倍性育种创造出来的多倍体植物具有植株粗壮、叶质增宽厚、适应性增强及次生代谢物质积累高等特点[2]。本研究以桔梗组培苗的茎和茎段为材料,通过不同质量分数的秋水仙素处理,以期获得四倍体植株，并利用无性繁殖的方式固定其优良性状，使之保持稳定而不分离，在生产上长期利用。

目前，桔梗在组培快繁、化学成分、分类鉴定、品种资源调查等方面［3－8］的研究较为广泛。另外在四倍体育种方面也有一些研究。王小华等[9]用含0.1%秋水仙素处理嫩茎40h，诱导频率达50%；朱京斌等[10]用0.2%秋水仙素和2%dmso浸泡山东桔梗愈伤组织16h，多倍体诱导率达43.3%。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

研究目标:

用不同浓度的秋水仙素在不同时间段浸泡桔梗幼苗，研究诱导桔梗四倍体的最适条件，并用形态学、细胞学、流式细胞仪三个方面鉴定桔梗四倍体。为生产实践和育种工作提供有力的实验依据。

3. 研究的方法与方案

研究方法与实验方案：

试验材料

挑选籽粒饱满的种子，用肥皂水清洗3次，涮干净肥皂沫后装于纱网中流水冲洗1h。在超净工作台上，将甩干水分的种子浸入75％的酒精中浸泡30s，用无菌水清洗4次后转入0.1％的HgCl2中灭菌4min，接入MS培养基，在温度(252)℃,光照度1500～2000lx,光照时间12h/d的条件下培养，每25d继代一次。

试验方法

1、桔梗无菌快繁体系的建立

以野生桔梗种子为试验材料，用0.1％的HgCl2消毒后建立无菌系，采用均匀设计法对桔梗的增殖及生根培养基进行优化，并对试管苗移栽基质进行筛选。

2、桔梗同源四倍体的诱导

将无菌苗下胚轴、分化的嫩芽及愈伤组织，分别置于含0.05%、0.1%、0.2%(质量分数)的秋水仙素溶液中进行振荡培养，每一质量分数的处理时间分别为12h、24h、36h、48h，以未经秋水仙素处理的培养材料为对照。处理完毕后，将诱导材料用无菌水清洗4～5次，分别接到MS固体培养基中，每个处理做5次重复。（处理方法如下表1）

表1：桔梗四倍体诱导的处理方法

3、桔梗同源四倍体的鉴定

（1）形态学鉴定

观察桔梗四倍体与二倍体植株外形差异。移栽大田后测量植株的株高和茎粗。

（2）细胞学鉴定

采用压片法对染色体计数。切取经不同质量分数秋水仙素处理的植株根尖(长约1cm)置于0.002mol/L的8-羟基喹啉中预处理2h,洗涤后的根尖放入卡诺固定液经4℃条件下固定2h,再放入1mol/L盐酸中水解5min。最后再经充分洗涤后置于载玻片上,加入1~2滴苯酚品红染色30min后制片并摄像。

（3）流式细胞仪鉴定

具体方法参照朱道圩等的测定方法：取组培苗叶片3～4片，用滤纸吸干水分，置干净的培养皿中。加0.5ml预冷的组织解离液(15mmol/LTris，20mmol/LNa2EDTA，80mmol/LKCl，20mmol/LNaCl，0.1%TritonX-100(V/V)，用锋利的刀片迅速将叶片切碎，用200目尼龙网过滤后离心，漂洗，加入DAPI染色液后静置10min，上机测定样品DNA含量。

技术线路：

可行性分析：

1.客观条件（实验室条件，仪器设备条件等）：

本实验是借用园艺院蔬菜组吴老师组培实验室，可以保证桔梗组培正常的进行；高压灭菌锅、超净工作台等必备的仪器设施齐全；各类基本药品、试剂均可直接从实验室获取。

2.主观条件（指导老师，项目成员基础）：

由长期从事药用植物多倍体育种研究的专业导师指导，并且指导老师在多倍体育种控制方面已有深入研究。本人是中药专业学生，学过植物组织培养、无机化学、有机化学、生物化学以及植物生理学等课程，有一定的理论基础；同时也做过相关的课程实验，仪器使用熟练，动手能力较强；在实验开始之前，阅读过大量的相关文献，制定了完备、可靠的实验方案，准备工作充足。

综上所述，本实验可行。

4. 研究创新点

随着桔梗需求量的不断增加，获得高产、优质桔梗已成为越来越多人奋斗的目标，而四倍体桔梗刚好符合生产需求，更重要的是四倍体桔梗在育种方面有极大的发展空间。之前有关于桔梗四倍体诱导的研究，但条件不太稳定，存在嵌合体。本实验通过秋水仙素浸泡桔梗幼苗，确定最佳的诱导条件，又从三个方面筛选四倍体，保证四倍体的确定性和稳定性，对桔梗四倍体的诱导、鉴定和育种工作提供了理论依据。

5. 研究计划与进展

本试验计划在2014年2月～2014年6月内完成：

2013.6～2013.8：查阅文献，确定试验方案，初步建立桔梗快繁体系。

2013.9～2014.1：完成桔梗每个生长阶段最佳培养基的筛选；秋水仙素诱导及采用形态学、细胞学、流式细胞仪对桔梗诱导材料进行初步鉴定。