1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
研究意义：
十字花科植物菘蓝(isatis tinctoria l.)根和叶均为常用中药，以其根入药称为板蓝根，叶入药称为大青叶 ，均有清热解毒 、凉血消斑之功效[1]。作为临床配方及制剂的大宗药材，菘蓝有效成分还能较好的抑制甲型流感病毒的增殖[2]。大青叶主要含靛蓝、靛玉红等吲哚类成分，靛蓝、靛玉红具有保肝、抗菌等多种药理活性[3]，板蓝根的多糖作为主要活性成分之一，已有报道能促进t细胞、b细胞、nk细胞等免疫细胞的功能，有调血脂作用 [4]。板蓝根中的（r,s）-告依春是抗病毒的主要活性成分之一[5,6]。板蓝根临床上常与荆芥、薄荷、金银花等组成复方，广泛用于治疗病毒感染性疾病。此外，还用于治疗急慢性咽喉炎 、流行性乙脑炎、水痘、单纯疱疹性角膜炎、带状疱疹、肾病、尿毒症等[7] 。因此，菘蓝作为一项重要中药资源，在国内中医药界颇受青睐。菘蓝用药量的继续增加，提高菘蓝产量和品质直接关系到生产的经济效益，从而影响到生产的发展。目前菘蓝的研究主要集中在化学成分、药理活性、制剂工艺、临床应用及组织培养等方面，关于药用植物的次生代谢物质与多糖的关系研究鲜有报道，为此，研究不同施氮水平下对菘蓝叶中靛蓝和靛玉红含量、根中（r,s）-告依春与多糖含量的影响，以靛蓝、靛玉红、多糖和（r,s）-告依春为综合指标考察板蓝根的质量，探明多糖和次生物质的关系，确定适宜菘蓝活性成分积累的施肥水平，为菘蓝的优质栽培提供一定的科学依据，对采取适宜的肥水和栽培管理措施和获得高质量药材有重要意义。
国内外研究概况：
2. 研究的基本内容和问题
研究目标:
了解不同施氮水平下菘蓝的次生代谢产物与多糖的关系
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
（1）靛蓝、靛玉红测定
准确称取粉末0.5000g，分别置于索氏提取器中，加氯仿适量浸泡15h，于80℃水浴加热回流提取至无色。将提取液减压浓缩蒸干，残渣用甲醇分次溶解并定容至100mL容量瓶中，摇匀。经0.45μm微孔滤膜滤过后，用超高效液相色谱仪对样品中靛蓝、靛玉红进行测定，并以色谱峰面积和标准曲线计算其含量。
UPLC色谱条件：流动相甲醇-水（72:28）为流动相；流速0.400mlmin-1；注温30℃；紫外线检测波长为289nm；进样体积5l。
（2）（R,S）-告依春测定
准确称取菘蓝干燥根粉末1.000g，置圆底烧中，精密加入水50mL，称定重量，煎煮2h，放冷，在称定重量，用水补足减失的重量，摇匀。滤过，取续滤液，即得。经0.45μm微孔滤膜滤过后，用超高效液相色谱仪对样品中表告依春进行测定，并以色谱峰面积和标准曲线计算其含量。
UPLC色谱条件：流动相甲醇-0.02%磷酸溶液（7:93）为流动相；流速0.400mlmin-1；注温30℃；紫外线检测波长为245nm；进样体积5l。
（3）多糖测定
采用苯酚-硫酸法测定多糖量。分别精确称取板蓝根粉末0.199，0.200，0.201 g,用80%乙醇浸泡过夜，再用索氏提取器用80%乙醇回流2 h，残渣挥去溶剂后，继续用水回流2 h，反复洗至250 mL量瓶中，定容，摇匀成为样品液。测定时，精确吸取样品液1 mL，按测定标准曲线方测其吸收值，再按下式计算样品中多糖量：多糖量＝CDf/M，C为样品液中葡萄糖的质量浓度，D为样品溶液的稀释倍数，M为样品质量，f 为换算因素。
技术路线：
实验方案：
（1）菘蓝栽培前的土壤营养状态分析：于2013年5月上旬采取江浦园艺实验站的土样，进行土壤的营养状态分析。
（2）菘蓝的栽培：实验地设在南京农业大学江浦园艺站实验基地，于2013年5月进行菘蓝的田间栽培，之后进行常规的田间管理。
（3）施氮处理：菘蓝种植小区面积为3.75m2（1.5m*2.5m），行株距25cm*7cm， 7个施氮水平（其中0施氮组为对照，根灌等量清水代替，见表1），每个处理重复3次，小区间距40cm，沟深30cm，四周设1m宽保护行。
表1 菘蓝7个施肥水平处理
组别 | 对照（CK) | 全硝（O） | 全铵(H) | NH4 ‐N∕NO3‐N=75:25 (Q) | NH4 ‐N∕NO3‐N=50:50 (W) | NH4 ‐N∕NO3‐N=25:75 (A) | 全有机N (Y) |
NH4 ‐N | 100 | 75 | 50 | 25 | |||
NO3‐N | 100 | 25 | 50 | 75 | |||
NH2‐N | 100 |
（4）采样及预处理：施氮处理后选择适宜时间进行采样，之后于60℃下烘干，粉碎，备用。
（5）活性成分的测定：将干燥粉碎处理的样品，参照《中国药典》的方法进行提取，采用超高效液相色谱法测定其地上部分的靛蓝与靛玉红的含量，测定地下部分的（R,S）-告依春和苯酚-硫酸法测定多糖的含量，分析不同施肥水平下菘蓝的次生代谢物质与多糖的关系。
可行性分析：
1. 客观条件
江浦园艺实验站栽培条件完善，中药材科学实验中心的实验室具备实验条件，各类药品、试剂均可直接从实验室获取。
2. 主观条件
该课题由长期从事菘蓝研究的专业导师指导，并且指导老师在菘蓝的质量控制方面已有深入研究。而申请人本科阶段已完成无机化学、有机化学、生物化学、中药化学以及药用植物栽培学等课程学习和考核，有一定的理论基础；曾参与适宜菘蓝生长及活性成分积累的氮素形态的SRT项目研究，仪器使用熟练，动手能力较强；在实验开始之前，阅读过大量的相关文献，制定了完备、可靠的实验方案，准备工作充足。
综上所述，本实验可行。
4. 研究创新点
从不同施氮水平下菘蓝次生代谢物质与多糖累积差异方面初步分析菘蓝的有效成分的积累规律，为生产高质量菘蓝提供理论依据。
5. 研究计划与进展
研究计划：
实验预期为1年：
2013年4月下旬：完成实验方案的设计
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