北沙参愈伤组织诱导条件优化开题报告

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

研究方法与实验方案：

实验材料

将获得的北沙参幼嫩叶片、嫩茎及芦头分别用流水冲洗干净，肥皂水浸泡30min，再以流水冲洗两遍，在超净工作台上，用75%酒精浸泡8s，无菌水冲洗4次，0.1%升汞灭菌20min（芦头灭菌30min），无菌水冲洗6次。在滤纸上，叶片切成0.5cm*0.5cm小块（嫩茎切成0.5cm长小段，芦头切成0.3cm小段）后接种入含不同激素配比的MS基本培养基（个组合见表1）中，在温度(252)℃,光照度1500～2000lx,光照时间12h/d的条件下培养，待形成愈伤后每20天继代一次。

表1 北沙参愈伤组织诱导实验方案

实验方法

1、北沙参愈伤组织诱导

实验设置6-BA、NAA进行组合正交实验。6-BA浓度设0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L四个水平，NAA设0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L四个水平，正交设计16个处理，见表1。

将准备好的外植体材料接种到不同处理的培养基上，每瓶4个外植体，每处理2瓶，重复3次。置于培养室培养，每天观察记录外植体生长状况，30天后记录愈伤组织诱导情况。

2、北沙参愈伤组织继代培养

MS为基本培养基，6-BA1.0mg/L，分别于NAA0.1mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L 和 2.0 mg/L 四种浓度配比；以 NAA 1.0 mg/L，分别于 6-BA 0.1 mg/L、0.5 mg/L、2.0 mg/L 三种浓度配比。待愈伤组织长成 1cm 左右大小时 (40 d 左右)，在无菌条件下切成 0.5cm0.5cm 左右转接至不同浓度的继代培养基上进行培养，重复 3 次。30 d 后统计愈伤组织的增殖系数。

增殖量=植入后愈伤质量-植入愈伤质量。

增殖系数=增殖量/植入后愈伤质量。

3、 丛生芽的诱导

选取少量将带有少量外植体的北沙参愈伤组织切下接种到6-BA2.0mg/L，NAA0.2mg/L的MS芽诱导培养基上进行培养，培养温度28℃，光照强度2000 lx，每天光照12 h。每瓶接种4~6块，每隔3~5天定期观察芽体生长情况，并根据诱导的结果筛选出适宜培养基配方，运用最适培养基进行所有北沙参种质材料的培养。

4、 根的诱导

当在培养基中诱导出的芽长度超过1 cm时，从芽丛上切下来，接种到1/2MS 蔗糖15g/L 琼脂6g/L 活性炭0.2g/L的生根培养基上，诱导生根。培养温度28℃，光照强度2000 lx，每日光照12 h。30 d后观察生根的情况。每瓶接种2~3棵，每隔3~5天定期观察根的形成情况，并根据诱导的结果筛选出适宜培养基配方，运用最适培养基进行所有北沙参种质丛生芽材料的培养。

5、 炼苗和移栽

在超净工作台上先将装有健壮生根试管苗的培养瓶瓶塞打开，用镊子轻轻提起幼苗0.5~1.0 cm高，使近茎部根系稍稍离开培养基，再将洗净烘干后的细沙倒在培养基上，铺沙厚度在1.0 cm左右，再将瓶塞旋上一半，（注意不要旋紧瓶塞以保持培养瓶内外通气）2天后将试管苗栽入移栽基质中，基质全部经过121 ℃ 20 min湿热灭菌。加1/10古典水培营养液后搅拌均匀以有水珠稍稍渗出为宜，用木棍打孔栽苗，再在基质上覆盖一层1.0 cm后的干燥细沙，栽完后直接将瓶盖放在瓶口上以保持瓶内湿度有利于缓苗。10 天后揭开瓶盖，喷施吡虫啉以防止幼叶遭受虫害。基质配比：1/3园土 1/3草炭 1/3细沙或1/3园土 1/3草炭 1/3蛭石

无菌苗

可行性分析：

1. 客观条件（实验室条件，仪器设备条件等）：

本实验是使用本专业组培科研实验室，可以保证北沙参组培正常的进行；高压灭菌锅、超净工作台等必备的仪器设施齐全；各类基本药品、试剂均可直接从实验室获取。

2. 主观条件（指导老师，项目成员基础）：

由长期从事药用植物组织培养研究的专业导师指导，并且指导老师在药用植物组织培养及其他学科方面已有深入研究。本人是中药专业学生，学过植物组织培养、无机化学、有机化学、生物化学以及植物生理学等课程，有一定的理论基础；同时也做过相关的课程实验，仪器使用熟练，动手能力较强；在实验开始之前，阅读过大量的相关文献，制定了完备、可靠的实验方案，准备工作充足。

综上所述，本实验可行。

特色或创新之处

随着北沙参需求量的不断增加，获得高产、优质、耐性强的品种已成为研究目标，而北沙参品种选育有赖于野生种植资源。野生北沙参资源几年来受人类干扰已濒临灭绝，很多野生资源缺乏研究所需的充足材料，植物组织培养所获得的大量无菌苗可解决这一难题。本实验通过不同部位为外植体，设置多种激素梯度组合以筛选最适培养条件，为以后的科研实验做参考。

研究计划及预期进展

本试验计划在2014年1月～2014年6月内完成：

2013.6～2013.8：查阅文献，确定试验方案，初步建立北沙参快繁体系。

2013.9～2014.1： 以北沙参叶片为外植体，做预实验，考察后续实验中可能出现的问题。并作好解决方案。

2014.1～2014.4：获得实验材料，对材料进行植物组织培养实验。

2014.4～2014.6：完成数据整理及撰写毕业论文，准备答辩。

预期研究成果

通过实验，筛选出最适诱导愈伤组织的处理组合，使得北沙参愈伤组织诱导条件得以优化。建立北沙参快繁体系。

已具备的条件、尚缺少的条件和拟解决的途径（包括利用教学实验中心、科研实验室、实习基地、校外其它企事业单位等条件的计划与落实情况）

（1）项目所需的实验材料来自指导老师的试验田，材料来源丰富。

（2）中药教学实验中心的实验室在生理、生化方面具有较好的实验基础和技术条件，具有组培、鉴定的实验仪器，能满足实验的需求。

（3）本人接受过较好的理论与实践教育，对桔梗早有接触；且在实验之前查阅了大量的相关文献，制定了完备、可靠的实验方案，为实践操作做了充分的准备。

尚缺少的条件和拟解决的途径：尚缺研究经费。

拟解决的途径：经费部分由指导教师经费支持。