双酚A对鸡胚雄性性腺发育的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题的意义中国是当今世界上家禽饲养最多的国家，在最近的几年来，随着人民生活水平的不断提高，各种物资需求也越来越大，其中就包含着人们对于禽类产品的需求。

过去的生长快、肉质差的肉鸡品种已经不再受到消费者的欢迎，所占市场份额也在逐年缩小，高肌肉品质的肉鸡更受到消费者的青睐。

如何在提高家禽的生产性能的同时保证禽肉的品质，避免相关生殖疾病的影响成为越来越多的人进行的研究课题。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容和拟解决的关键问题1.项目研究目标： （1）以e15.5，e18.5和e20.5的雄性鸡胚性腺组织素材，研究双酚a处理后不同时期的雄性鸡胚性腺生长发育规律；（2）制作雄性性腺石蜡切片，观察各个时期的形态大小差异，分析双酚a对于雄性性腺发育形态上的影响；（3）采用dna，rna测量技术，检测相关基因在雄性鸡胚性腺组织中的表达规律，分析双酚a对于雄性性腺的影响，旨在为优质鸡专门化品系和配套系的选育提供技术支撑。

2.项目研究内容（1）培育鸡胚，探究e15.5，e18.5和e20.5的雄性鸡胚性腺的发育变化及组织表达差异性。

分别于这三个时间点采集性腺样品，荧光定量pcr反应检测基因表达情况。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

本次实验的主要流程为：在旋转孵化箱内孵化种蛋共150枚，在E10.5天时，2/3的鸡蛋注射0.05ug/mL的BPA作为处理组，1/3的鸡蛋注射PBS溶液作为对照组（隔一天进行注射）。孵化至E15.5，E18.5，E20.5三个时期采集鸡胚性腺组织，用作切片，DNA和RNA等实验材料。

技术路线：

（1）双酚A注射

采集E15.5，E18.5和E20.5的鸡胚性腺组织，并对鸡蛋蛋重，鸡胚重，蛋胚比进行记录比较，数据分析通过方差分析使用SAS 9.0软件。P 0.05被认为是显著的差异。

（2）石蜡切片制作

1） 固定：4% 甲醛固定至少24h，流水冲洗3h以上(过夜)

2） 脱水：50% 酒精3h以上（可以在里面过夜）

70%酒精2 h以上（可以在里面过夜）

80%酒精2 h（或在里面过夜）

95%酒精Ⅰ 1 h

95%酒精Ⅱ 1 h

100%酒精Ⅰ 30 min

100%酒精Ⅱ 30 min

3） 透明：二甲苯酒精1：1溶液15 min或稍长

二甲苯I 10 min（建议稍微长一些，大部分发亮为标整）

二甲苯II 5 min

4） 包埋： 二甲苯石蜡1：1 15 min

石蜡Ⅰ 1 h

石蜡Ⅱ 20 min（建议：如浸蜡不好时间可以稍长一些）

注意：培养的是不是很小，就必须减少时间。

切片贴片：厚度5-10微米，48到60度之间的水温贴片。60℃烤片8 h。

（3）HE染色

1）脱蜡 ： 二甲苯Ⅰ 6 min

二甲苯Ⅱ6 min

2）浸水： 100%酒精Ⅰ 4 min

100%酒精Ⅱ4 min

90%酒精 3 min

80%酒精 3 min

70%酒精 3 min

蒸馏水 3 min

3）染色： 苏木精染液 3min

自来水冲洗2 min左右

酸水分色 （0.5 mHcl）15 s，提3下左右（1%的盐酸和70%的酒精）

自来水浸泡 30 min左右 兰化

4） 脱水：70%酒精 3 min

80%酒精 3 min

90%酒精Ⅰ 3 min

5）伊红： 30s

95%酒精Ⅱ 30 s

100%酒精Ⅰ 3 min

100%酒精Ⅱ 3 min

6）透明： 二甲苯Ⅰ 5 min

二甲苯Ⅱ 5 min

7）封片： 滴加中性树胶，再用盖玻片封片

（4）DNA提取

1) 破碎：将分离出不同胚龄生殖嵴或性腺置于均质管中，放入3-5颗磁珠，加入1 ml2 %的CTAB提取缓冲液和2 %PVP-40，均质仪破碎30 s；

2) 裂解：破碎后的溶液转入2ml EP管中，再加入20μlβ-巯基乙醇，涡旋混匀，65 ℃水浴1 h，水浴过程中振荡3次左右；

3) 抽提：向离心管中加入500μl氯仿：异戊醇（24:1），颠倒充分混匀5min，室温，12000 rpm离心15 min；

4) 重抽提：吸取500μl上清液，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀，室温，12000 rpm离心10 min；

5) 沉淀：吸取上清液，加满-20 ℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀。4℃冰箱静置30 min，4 ℃，8000 rpm离心10 min，白色沉淀即为DNA；

6) 洗涤：弃上清，-20 ℃预冷的75 %乙醇洗涤，涡旋震荡，4 ℃，10000rmp离心两次，每次10min；

7) 风干和溶解：用微量移液器将EP管中剩余液体吸尽，置于超净台内风干，直至DNA呈透明状，加入20μl ddH2O溶解；

8) 测定：紫外分光光度计测定DNA浓度，A260/A280在1.6-1.8 DNA纯度良好；

9) 稀释：将DNA稀释至300 ng/μl，4℃储存备用。

（5）DOT实验

1)在尼龙膜上用铅笔轻轻标记点样位置，按浓度梯度在相应位置加上不同处理组的DNA样品，在室温条件下，干燥15 min；

2)在1200 J/cm2的紫外交联仪上交联10 min；

3)将尼龙膜置于5%脱脂奶粉在室温条件下封闭1 h；

4)含有5 %脱脂奶粉的TBST1000倍稀释相应的一抗，在4 ℃条件下孵育12 h。在摇床上置于TBS-T中清洗3次，每次5min；

5) 含有5 %脱脂奶粉的TBST5000倍稀释HRP标记的二抗，室温条件下在摇床上孵育2 h。在摇床上置于TBS-T中清洗3次，每次5min；

6) 使用ECL显色液在暗室显影，上机检测。

（6）总RNA提取

1）采集卵巢组织，现用匀浆机破碎，然后加入1 ml Trizol充分匀混匀，转移到1.5ml RNase free EP管中，室温静置5 min后；

2）然后加入200 μl氯仿，剧烈振荡15-30s，充分混匀。

3）使用冰冻离心机在4℃的条件下，以12，000 rpm的转速离心15min，离心结束后，可看到管内分三种不同的部分，分别为无色水相，中间氯仿相以及红色的酚相；

4）RNA沉淀：在RNase free EP管中加入400 μl的异丙醇，然后小心吸取400 μl上层水相，充分混匀，4℃的条件下静置15 min，以12,000rpm离心10 min；

5）用移液枪小心吸走上清液并弃掉，然后用1 ml 75%的无RNA酶的酒精清洗沉淀，剧烈震荡，在4℃的条件下，以7,500 rpm离心10min，在超净台内放置风干；用20ul无RNase free溶解的RNA，并置于-80℃的冰箱保存备用。

6）总RNA浓度的测定：ND-2000微量分光光度计RNA的浓度及纯度。RNA的纯度在1.8~2.1为纯度良好，即OD260/OD280（A260/280）的比值。

(7)cDNA的合成

反转录操作步骤如下：

1）准备反转录试剂（置冰上）；

2）依次往PCR管加入以下试剂：

试剂 使用量

5X PrimeScript RTMaster Mix (Perfect Real Time) 2μl

Total RNA 500ng

RNase Free dH2O Upto10μl

3）反应程序：混匀离心后在PCR仪上37°C，15 min；85°C，5 s；然后将所得cDNA产物于4 °C保存；（也可室温静置10 min后上机）

4）用Primer 5.0软件设计引物，送至金唯智生物工程技术有限公司合成，引物序列、产物长度及退火温度等如表2-1所示。引物用灭菌的双蒸水稀释至100 uM浓度，-20℃储存；使用浓度为10 uM，于4℃放置。

PCR的扩增,反应体系为20 ul

试剂 使用量

cDNA 模板 2.0 ul

Taq 酶 10ul

上游引物 0.5 ul

下游引物 0.5 ul

ddH2O 调至总体积20 ul

反应条件：

95℃ 3 min1 cycle

94℃ 30 s

60℃ 30 s 34 cycles

72℃ 1 min

72℃ 5 min1 cycle

4℃ Forever

（8）引物设计

运用NCBI找出基因登录号及基因序列，通过Primer3.0软件进行引物设计。本次实验所设计的引物如下：运用NCBI和Primer3 Input软件对鸡的减数分裂和DNA甲基化等基因进行引物设计，并送与金唯智公司合成(见表1)。

表1.荧光定量PCR引物序列表

Table.1 Primers are for QTR-PCR analysis.

Gene

Accession no

Primer sequence (5’ to 3’)

Product length (bp)

Dazl

NM_204218

gtcaacaacctgccaaggat

tccacattgtccaggaatga

207

β-actin

NM_205518

atgaagcccagagcaaaaga ggggtgttgaaggtctcaaa

223

Cav

NM_00110566

tggaaggccagttttaccac

gcccatagcctcaaacagag

240

piwi

NM_001098852

Tcacctgagcaaagacaac

tcccgtaaaggacagtaag

126

（9）半定量分析

1)制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3M)。

10×MOPS电泳缓冲液

浓度 成分

0.4M MOPS，pH 7.0

0.1M 乙酸钠

0.01M EDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

2)电泳

上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

3)紫外透射光下观察并拍照

可行性分析：

4. 研究创新点

1. 观察不同时期雄性鸡胚的性腺发育机制

2. 用双酚A作为影响因子来设计实验

5. 研究计划与进展

2018.9-2018.10

（1）实验的前期准备，资料检索，优化实验方案。

（2）种蛋孵化，取不同胚龄雄性鸡胚性腺进行切片，he染色比较不同时期雄性性腺发育变化。