江苏及周边地区猪德尔塔冠状病毒S基因的全长序列测定及进化分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

冠状病毒（coronavirus, cov）属于冠状病毒科，与动脉炎病毒科共同属于尼多病毒目。

根据基因组进化树分析，冠状病毒科又包含四个属：alpha-co v、beta-co v、gamma-co v和 delta-co v。

而最近爆发的冠状病毒主要感染人类、骆驼、猪等哺乳动物，涉及到alpha-co v、beta-co v 和 delta-co v，范围较广[1]。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：对从江苏周边地区送检的PDCoV阳性临床病料进行S基因的全长序列及序列分析，通过对S基因进行进化树分析及氨基酸位点分析研究PDCoV 的进化情况及抗原变异程度，为PDCoV的有效防控提供理论依据。

研究内容1.对PDCoV阳性临床病料进行处理，提取病料的核苷酸，运用RT-PRC的方法进行鉴定2.通过RT-PCR扩增阳性样品的S基因片段并全长，分3段扩增后送检测序3.拼接序列，构建全长S基因的分子进化树，分析S基因遗传变异情况拟解决的问题通过分析PDCoV S基因全长序列分析在江苏周边地区流行毒株的遗传变异情况，为预防和控制该病原在猪群中的传播奠定基础。

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法与实验方案1.病料处理与核苷酸提取 采取组织加10 倍体积裂解液进行研磨匀浆，37 ℃ 孵育 1 h；将800 μl 匀浆液加入离心管中（不超过 1/3），加入8 μl 蛋白酶k，50 ℃ 水浴3 h，冷却至室温；反复冻融三次，使病毒灭活。

根据病毒rna\dna提取试剂盒的说明书进行dna\rna的提取。

2.rna反转录 使用随机引物法把提取的rna反转录成dna3.pcr鉴定阳性病料与s基因扩增 根据pdcov鉴定试剂盒或设计引物，利用pcr的方法从阳性样品中扩增出鉴定片段和完整的s基因片段,通过琼脂糖凝胶电泳后产物大小进行病毒的鉴定。

4. 研究创新点

作为新发病原，PDCOV的研究相对较少，PDCoV的流行及变异情况也并不明了，本研究对江苏及周边地区的PDCoV阳性病料进行S基因的序列测定及变异分析，为该病毒的流行病学研究提供及时的资料及基础

5. 研究计划与进展

第一阶段（2017.10-2017.11）：熟悉实验室的环境与基本操作的学习 第二阶段（2017.11-2018.01）：设计引物，通过RT-PCR扩增阳性样品的S基因片段并全长，分3段扩增后送检测序 第三阶段 (2018.02-2018.05)：拼接序列，构建全长S基因的分子进化树，分析S基因遗传变异情况