β-葡萄糖苷酶的提取纯化及酶促动力学研究开题报告

1. 研究目的与意义

研究背景：

（一）木质纤维素

木质纤维素生物质作为世界上资源来源最广泛的可持续材料和在全球工业中应用最广泛的材料，已成为一种极有前途的环境资源。酶催化是各种处理方法中最环保和最有效的工具之一，被用于将生物质转化为化学品和燃料。β-葡萄糖苷酶（bgl），进一步解构纤维二糖和短链纤维寡糖endo-β-14-葡聚糖酶（eg）和exo-β-14-葡聚糖酶（cbh）催化葡萄糖，是最敏感的组件协同酶系统组成的三种酶，非常容易被外部条件失活，成为生物质的限速组件转换。
木质纤维素生物质的顽固性是细胞壁的复杂结构。植物细胞壁由纤维素、半纤维素和木质素三种特征组成。. 纤维素是一种由β-1,4-糖苷键连接的糖基聚合物，作为木质纤维素生物质中第二丰富的成分，半纤维素由戊糖、己糖和糖酸聚合。木质素是木质纤维素残基的另一个主要成分，通过与纤维素和半纤维素形成致密结构，作为植物细胞与外部环境致命因素的封闭物。
分解纤维素的纤维素酶由三种协同酶组成，分别称为内-β-1、4-葡聚糖酶（eg）、外-1、4-β-葡聚糖酶（cbh）和β-葡萄糖苷酶（bgl）。这些酶将纤维素分解为小分子碳水化合物，通过随机分解葡萄糖-聚合物链分解非定形纤维素，使聚合纤维素分解成纤维素链。cbh通过作用于纤维素链的自由还原端和非还原端来释放纤维素二糖。最后，bgl有助于将纤维二糖和短链纤维寡糖分解为葡萄糖。
在这三种酶，bgl是最脆弱的，很容易灭活许多因素如温度、ph、葡萄糖和其他抑制剂，导致最重要的问题，低水解效率大量的研究人员专注于提高阻力能力bgl对糖化的影响因素。但bgl的失活机制尚未得到系统的研究。
（二）β-葡萄糖苷酶
在自然界中，大多数bgl的功能是水解低聚糖和糖苷中的糖苷键，释放非还原的末端糖基残基。微生物中的其他酶可以利用这些d-葡萄糖来生产生物燃料、精细化学物质和药物，bgl不仅在分解双糖形成单糖方面发挥了很大的作用，而且其在其他领域的重要性不应被忽视。 例如，啤酒酵母中的bgl可以从它们各自的糖苷前体中释放出萜烯醇、苄基醇和苯乙醇。在昆虫和植物中，β-葡萄糖苷酶参与从青色葡萄糖苷前体中释放氰化物，作为这些系统中显示的防御机制的一部分。此外，它在植物中的功能还包括水解植物激素前体、色素代谢、种子发育和生物量转化。此外，β-葡萄糖苷酶被认为是一种多功能的工业生物催化剂，经常用于精细化学品和药物生产。
目前对bgl催化机理的研究主要集中在gh1和gh3家族酶上。. 研究底物pnpg水解gh1家族bgl0224从球菌sd-2a详细描述，说明亲水氨基酸包括gln20，his132，glu178和glu377结合过程的主要部分首先，bgl0224的催化活性位点吸附底物pnpg，然后由于glu377的碳基氧原子攻击底物的c原子，底物的糖苷键断裂，glu178的氢原子被配体吸附形成可去除的对硝基苯酚，然后glu178和葡萄糖分别吸收水的氢离子和氢氧化物形成羧基和最终产物葡萄糖。还发现两个关键谷氨酸残基如glu178和glu377是bgl0224催化过程的核心，与海洋热原菌bgl的glu192和glu390类似。
此外，还对gh3的催化机理进行了深入的研究。yaw-kuen等研究了温曲霉和黑曲霉等多种菌株细菌中gh3的bgl。发现了gh3的bgl催化机制的以下共性。gh3的催化机理研究gh3使用dnp-glc，onp-glc和pcp-glc作为底物，表明gh3包含两步反应机制包括糖基化和脱糖基化有一个相对较晚的过渡状态的糖基化步骤，更类似于双分子亲核取代反应机制。相比之下，脱糖基化步骤更像是单分子亲核取代反应机制，因为它在过渡态中具有大量的碳阳离子性质。酶反应的中间产物为共价糖基酶中间产物。

2. 研究内容和预期目标

研究内容
（一）将已经成功连接编码β-葡萄糖苷酶的基因的大肠杆菌bl21活化培养；
（二）将活化后大肠杆菌接种至50ml培养基，进行扩大培养至od值为0.6进行诱导；
（三）超声提取粗酶液，并使用镍柱纯化提取β-葡萄糖苷酶纯蛋白；
（四）通过分解底物pnpg的产物pnp显色的原理测得酶学性质。

预期目标：分析实验数据，完成论文。

3. 研究的方法与步骤

研究方法：
1.1.1β-葡萄糖苷酶的提取纯化
（1）大肠杆菌bl21的培养：取5mllb培养基，50ul大肠杆菌bl21，5ul抗生素加到摇菌管中，放置摇床上摇12h后。

取摇菌管中500ul菌液接种于lb液体培养基（50ml）中加入50ul抗生素37c中培养三个小时后，加入100ul iptg后再在20c诱导20 h后，收集菌液。

（2）超声破碎法提取酶：将收集的菌液离心 15 min，8000 r/min，用pbs（ph 7.4 左右）洗涤两次次后，再用裂解液重悬菌体，冰浴超声破碎 15 min，超声破碎的条件：超声 5 s，间隙 5 s，总时间 15 min，功率 60% 。

4. 参考文献

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5. 计划与进度安排

1）2024-03-01～2024-03-07：查阅资料撰写开题报告；
2）2024-03-08～2024-03-09：将已构建的β-葡萄糖苷酶的工程菌进行活化培养；
3）2024-03-09～2024-04-11：将活化后的大肠杆菌接种至摇瓶进行扩大培养和诱导表达；
4）2024-04-11～2024-04-12：绘制pnp，蛋白质标准曲线；
5）2024-04-12～2024-05-17：测定酶的酶学性质以及热稳定性，耐溶剂特性，酶促动力学，失活动力学。

6）2024-05-18～2024-06-01：分析实验结果，整理实验数据。

7）2024-06-03～：撰写论文，英文翻译，修改补充论文，准备答辩。