β-葡萄糖苷酶异源表达及其与纤维素酶交联共固定化研究开题报告

1. 研究目的与意义

研究背景

纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上。植物在成熟和后熟时质地的变化则由果胶物质发生变化引起的。棉花的纤维素含量接近100%，为天然的最纯纤维素来源。一般木材中，纤维素占40～50%，还有10～30%的半纤维素和20～30%的木质素。

纤维素水解的产物不是一种有固定组成的化合物，而是一种水解程度不同的混合物，纤维素完全水解即为葡萄糖。纤维素在酸的作用下由长链、分子量大、交联程度高水解成较短纤维素分子，在纤维素酶的作用下产生葡萄糖。纤维素酶分为内切纤维素酶、外切纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶，其中β-葡萄糖苷酶是水解纤维素最主要的酶，主要负责纤维素经内切和外切酶处理后产生的纤维二糖。

2. 研究内容和预期目标

主要研究内容

1.对β-葡萄糖苷酶进行异源的表达

2.提取β-葡萄糖苷酶，对其不同反应条件下活力的测定

3.对β-葡萄糖苷酶与纤维素酶进行固定化并探究其最是反应条件

本实验可能需要的实验仪器有：恒温震荡培养摇床、台式离心机、分光光度计、pcr仪、超声破碎仪、超声波清洗器、分析天平、真空冷冻干燥机、4℃电冰箱、温度计、水浴锅、高压灭菌锅等。

预期目标：

3. 研究的方法与步骤

本课题拟采用的研究方法、步骤：

1. bg突变体的构建

1.1 bg及突变株质粒提取

质粒抽提按照fastpure plasmid mini kit说明中的内容进行。首先取1-5 ml培养12h的菌液加入离心管中，10000 g离心1 min，弃培养基，倒扣于吸水纸上吸尽残液，加入250 μl 含有rnase a酶的缓冲液p1，涡旋振荡混匀至菌体彻底重悬；随后加入250 μl 缓冲液 p2，温和上下颠倒混匀8 - 10次，使菌体充分裂解至溶液清澈；再向离心管中加入350 μl 缓冲液 p3，立即温和上下颠倒混匀8 - 10次使缓冲液 p2彻底中和，此时应出现白色絮状沉淀；13000 g离心10 min后，吸取上清液至吸附柱上；13000 g离心30 - 60 sec，弃收集管中的废液；向吸附柱中加入600 μl 经无水乙醇稀释过的缓冲液 pw2，13000 g离心30 - 60 sec，弃废液，重复该步骤；随后13000 g开盖离心1 min干燥吸附柱以彻底去除残留乙醇；向吸附柱膜中央滴入30 - 50 μl elution 缓冲液后室温静置2min，13000 g离心1 min洗脱dna于新的无菌离心管中；通过nanodrop 2000超微量分光光度计分析其dna含量，保存于-20℃防止dna降解。

1.2 引物设计

根据突变位点设计pcr所需双向引物。

1.3 pcr扩增bg突变体

1.3.1 pcr定点突变

从用于保存质粒、甲基化酶无缺陷宿主菌e.coli dh5α中提取用于定点突变的模板dna双链，在冰盒上加入所需溶液及试剂，模板质粒使用前应将其稀释至合理浓度，50 μl反应体系如表。

短暂离心后进行pcr扩增反应，退火温度、延伸时间分别根据引物tm值、扩增片段长度设置，条件如表。

反应结束后可取少量pcr扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测是否正确扩增，确认扩增无误可进行下步操作。

1.3.2 甲基化模板消除

pcr扩增产物中包含原始模板质粒，为防止转化过程产生假阳性转化子，须在重组环化之前进行dpn Ⅰ消化，去除甲基化模板质粒。在pcr扩展产物中加入1 μl dpn Ⅰ消化酶，轻轻吸打混匀后，短暂离心收集至管底，置于37℃恒温反应1 - 2 h。

1.3.3 重组反应

消化后的产物需进行重组反应以实现线性dna的体外环化。测定消化产物浓度后计算适合的用量，加入反应体系。对于多点突变，各片段的消化产物需同时加入。20 μl反应体系如表，需在冰上进行配置。

轻轻吸打混匀后短暂离心收集至管底，37℃恒温反应30 min后立即置于冰上冷却，

1.4 重组产物转化

在冰上解冻感受态细胞e.coli dh5α、e.coli bl21，取10 μl重组产物加入感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30 min；42℃水浴热激90 sec，立即置于冰上冷却2 min；在无菌环境下加入400 μl不含抗生素的lb培养液，摇床中37℃，200 rpm培养1 h后，8000 rpm离心5 min，弃400 μl上清后重悬，涂布至含卡那霉素抗性的固体培养基上；37℃恒温培养12 - 16 h，分别挑取多个单菌落于5 ml含有卡那霉素的lb培养液，摇床中37℃，200 rpm培养12 - 16 h，通过上海生工测序验证，获得bg突变株的真实序列，同时将突变株甘油管保存于-20℃备用。

2. β-葡萄糖苷酶活力的测定方法

采用pnpg显色法测定β-葡萄糖苷酶的酶活力。测定标准曲线方程为：y=17.425x 0.0045，线性相关系数r=0.9999。取0.2ml待测酶液（测定固定化酶活力时，则准确称取一定质量的固定化酶颗粒)与ph5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液混合)，加入5mmol/l的pnpg溶液0.2ml，于50℃恒温反应10min后，立即加入lmol/l naco溶液1ml终止反应（固定化酶活力测定时在终止反应前先过滤分离固定化酶)，待冷却后于波长410nm处测吸光度。以100℃加热失活的酶液按照同样方法处理作空白对照。
游离β-葡萄糖苷酶活力单位定义：在上述反应条件下，以每分钟水解pnpg，产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位（u)。固定化酶活力单位根据载体质量以u/g表示。采用该方法测定原始β-葡萄糖苷酶（游离酶）和固定化酶的酶活力。

4. 参考文献

[1] 姚轶俊,王立峰,鞠兴荣.纤维素载体固定化β-葡萄糖苷酶及其在大豆异黄酮水解中的应用[j].食品科学,2017,38(24):177-182.

[2] 杨仁俊. 木质纤维素高效预处理与β-葡萄糖苷酶固定化研究[d].天津大学,2016.

[3] 朱均均. β-葡萄糖苷酶的固定化及纤维素辅助水解技术[d].南京林业大学,2006.

5. 计划与进度安排

1）2024.2.27～2024.3.4：查阅资料、阅读文献、撰写开题报告；

2）2024.3.6～2024.25：文献翻译，β-葡萄糖苷酶异源表达；

3）2024.3.25～2024.4.2：β-葡萄糖苷酶蛋白提取，纯化；

4）2024.4.3～2024.4.29：固定化酶以及探究探究条件；

5）2024.4.30～2024.5.2：整理分析实验数据；