冇骨消对WIV1复制影响的研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

冠状病毒(coronavirus, cov)属于套式病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、冠状病毒亚科(coronavirinae)，是一类具有囊膜(envelope)的单链正义rna病毒。

冠状病毒亚科目前含有4个病毒属(alphacoronavirus, betacoronavirus, deltacoronavirus, gammacoronavirus)，这个4个属的病毒感染多种脊椎动物，其中多种病毒与人和其他动物的疾病有关[1]。

最早被发现的人类冠状病毒是hcov-229e和hcov-oc43，oc43株引起的症状一般比229e严重，这两种人类冠状病毒大部分只会造成上呼吸道和消化道的內皮细胞感染，是成人普通感冒的主要病原之一，在儿童可引起上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道[2， 3]。

2. 研究的基本内容和问题

1. 研究目标本研究中，将对中药冇骨消的四种有效成分：lg02brf2(k)、咖啡酸、绿原酸及其乙醇萃取物进行筛选，测试它们的细胞毒性和抗病毒活性，以期望找到有效抑制sars样冠状病毒wiv1复制的成分，为sars冠状病毒的治疗提供参考。

2.研究内容细胞毒性实验：观察四种药物成分对vero e6细胞的杀伤作用，测试4种药物的cc50。

抗病毒活性实验：(1)分别用荧光显微镜的明视野和绿色荧光视野观察细胞病变现象；(2)通过噬斑实验测试不同药物的不同浓度作用后的病毒滴度；(3)通过对细胞中绿色荧光蛋白的检测定量呈现药物的抗病活性；(4)通过实时荧光定量pcr定量病毒的增殖效率。

3. 研究的方法与方案

1. 研究方法和方案细胞毒性实验：制备适宜密度的96孔细胞培养板。

将稀释到需要浓度的四种药物加入相应的细胞孔，并加入适量培养基放入培养箱，每24h观察细胞状态并拍照，48h后用发光细胞活力法（luminescent cell viability assay）检查细胞活力。

抗病毒活性实验：(1)制备适宜密度的96孔细胞培养板。

4. 研究创新点

对于冇骨消四种成分的抗SARS样冠状病毒WIV1病毒能力进行比较，希望筛选出低毒高效的成分，由于WIV1于SARS具有高度同源性，该课题的研究结果可以为SARS的治疗提供参考依据。

5. 研究计划与进展

2015.9-2015.10 查阅文献，设计实验方案，准备实验需要的材料，熟悉实验操作。

2015.10-2015.12进行细胞毒性实验和抗病毒活性实验。

2015.12-2016.1 整理实验数据，分析实验结果，撰写论文。