基于GFP重组模拟表位的氯噻啉免疫分析方法的建立开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

农药残留超标事件威胁我国农产品消费安全，农药残留检测技术是保障农产品安全消费的重要抓手，目前我国农业生产经营总体分散，小、散、乱的特点突出，难以全部采用大型色谱仪器对农产品产前、产中和产后实施污染监测[1]。

因此，我国农产品质量安全监管，尤其是县乡农产品质量安全监管和抽检监测力度的加大迫切需求农药残留快速检测技术。

免疫检测技术具有简便、快速、低成本和可靠的特点[2 ]，非常有利于提高我国农产品的抽检监测力度。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：探究emgfp在研制纳米多肽竞争物方面的用途，使纳米化多肽竞争物在保持活性的同时能表现出荧光特性，建立基于emgfp重组模拟表位的氯噻啉免疫分析方法。

研究内容：建立基于emgfp重组模拟表位的氯噻啉免疫分析方法，经系统优化后用于真实样品的检测，并与传统免疫分析方法进行比较，明确有荧光特性的纳米多肽竞争物的特点，通过与现行的农药残留标准检测方法进行比较，对开发的免疫分析方法进行客观评价。

拟解决的关键问题：1、噬菌体展示多肽与emgfp融合表达的重组蛋白是否具有活性当emgfp重组蛋白与磁珠上抗体结合后，由于荧光内滤效应，磁珠会对emgfp显示出强烈吸收，在实验中能否检测到荧光信号

3. 研究的方法与方案

实验方案：（1）氯噻啉噬菌体展示多肽竞争物的分析在前期工作基础上，对已筛选到的氯噻啉噬菌体展示多肽竞争物进行氨基酸序列分析，明确各竞争物的多肽序列特征和结构稳定性，结合已测得各噬菌体展示多肽竞争物建立的酶联免疫分析方法的敏感性数据，确定用于制备纳米多肽竞争物的噬菌体展示多肽竞争物。

（2）活性多肽片段与emgfp融合表达使用含有多肽竞争物核酸序列的引物扩增emgfp基因，经纯化、酶切、连接构建重组质粒；通过热击或电击的方式将重组质粒转入大肠杆菌，平板培养转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行扩增培养，iptg诱导表达插入序列，收集表达的多肽融合蛋白。

（3）纳米多肽竞争物的纯化与活性测定对纳米化多肽进行蛋白层析纯化，并进行变性聚丙烯酰氨凝胶电泳验证；根据emgfp的特性，选择荧光免疫分析等方法对纳米化多肽竞争物进行活性验证。

4. 研究创新点

1、克服噬菌体颗粒带来的缺陷2、均相模式让分析更加简单

5. 研究计划与进展

2017.09.01-2017.10.01：搜集资料，整理文献，设计实验方案，完成论文开题2017.10.01-2018.01.01：活性多肽的制备2018.01.01-2018.01.20：磁珠的合成与修饰2018.01.20-2018.02.28：基于磁分离的荧光免疫分析方法的建立2018.02.28-2018.03.15： 数据整理，撰写毕业论文2018.05.30-2018.06.30：准备毕业论文答辩