大豆疫霉具有核定位信号的几个RXLR效应分子的克隆和亚细胞定位开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

大豆疫霉（phytophthora sojae）隶属于茸鞭生物界卵菌门疫霉属，能够侵染大豆，引起大豆根腐病，是大豆生产上毁灭性病害之一。全世界每年由于大豆疫霉根腐病引起的直接经济损失高达十几亿美元。相对于真菌和细菌，疫霉菌基因组较大并且遗传转化困难，对疫霉菌致病机理的研究进展非常缓慢。目前生产上一些防治真菌的药物对疫霉的防治效果并不是很突出，所以从分子生物学的手段研究大豆疫霉与植物互作的机制对于寻找新的杀菌剂靶标意义重大，有助于开发新的杀菌剂，为防止该病原菌制定策略提供理论依据。

同很多植物病原菌物一样，大豆疫霉在侵染植物的过程中也会分泌一些效应蛋白来干扰和破坏植物细胞与组织的正常生理代谢，促进病原物自身的侵染与繁殖。近年来的一些研究发现，大豆疫霉基因组中有将近400个rxlr效应分子，研究发现效应分子的rxlr motif可以与植物细胞膜上的pi3p结合，帮助效应分子进入寄主细胞内。本实验室之前对大豆疫霉rxlr效应分子的功能进行大规模的筛选，发现大多效应分子都能够抑制植物的细胞死亡，也有部分效应分子可以直接诱导植物免疫反应。

大豆疫霉的不同效应分子在植物细胞中的亚细胞定位不同，已有研究发现，效应分子功能的差异是与其定位的差异有联系的。大豆疫霉效应分子定位的差异造成了在病原物与植物互作的过程中功能形态的变化。有些效应分子具有核定位信号的功能，核定位信号对于效应蛋白入寄主细胞核起着重要的引导作用。本课题针对之前研究过的效应分子功能的筛选，挑选几个具有核定位信号的效应分子，进行克隆，并通过效应蛋白与绿色荧光蛋白（gfp）的融合蛋白在烟草细胞中瞬时表达，进行亚细胞定位实验，来进一步分析其效应分子的功能，阐述核定位信号在效应分子侵染寄主细胞中起到的作用，有助于进一步加深对植物与病原菌的互作机制的理解，以便于寻找更高效的防治疫霉的策略。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

之前的研究对于大豆疫霉的效应分子的功能有了一个初步的了解，但是这些效应分子究竟如何起作用，仍然不清楚。为了进一步了解效应分子在植物细胞中的作用机制，挑选几个具有核定位信号的效应分子，针对这些效应分子在植物细胞中的亚细胞定位进行研究，验证其效应分子是否定位于寄主细胞的细胞核，对效应分子的定位进行进一步的认识和研究。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1.根据研究的几个效应分子的基因序列设计上下游引物设计，以大豆疫霉菌株p6497的cdna为模板，采用高保真酶primer star进行pcr扩增。

2.通过对扩增出的片段进行琼脂糖凝胶电泳的方法，验证是否扩增出所需片段，以便进行下一步操作。

4. 研究创新点

特色或创新之处

构建重组质粒，重组质粒含有具有核定位信号的效应分子基因与荧光基因，通过农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达技术，将几个具有核定位信号的效应蛋白与GFP融合蛋白在烟草细胞中瞬时表达，分析验证了几个效应分子在细胞中的亚细胞定位（具有核定位信号的几个效应分子在寄主植物细胞中定位于细胞核）。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

2013年8月2013年9月 pcr进行基因克隆，酶切基因片段与质粒片段，用t4连接，构建载体

2013年9月2013年10月 将构好的载体转入大肠杆菌扩增，提取质粒进而电击转入农杆菌gv3101