Decapping protein 2 RNA脱帽蛋白基因沉默对TSWV复制的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus ,tswv)是布尼亚病毒科(bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(tospovirus)的典型成员。tswv寄主范围广，可侵染35科900多种植物，在世界范围内每年对重要农作物造成直接经济损失达10亿美元。目前已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一^[1]，也是一种入侵我国的危险检疫性病毒(国家质量监督检验检疫总局2006年进境植物检疫性有害生物名单)。

番茄斑萎病毒基因组属于负单链rna（-ssrna类型)，由三条基因组组成，从大到小分别被称为l-rna、m-rna和s-rna。其基因组rna的极性与mrna的极性相反，其病毒粒子的结构蛋白都由病毒基因组的反向开放阅读框编码^[2]。

目前，番茄斑萎病毒的致病机理还处于研究阶段。明确tswv的致病机理，对该种病害的防治有极其重要的意义。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标

通过构建dcp2的沉默表达载体，转入农杆菌gv3101。按设计浸润本氏烟植株。浸润24h后，摩擦接种tswv新鲜毒源，按时间梯度收集接种叶做western检测，从而验证dcp2对tswv复制的影响。dcp2的沉默表达，预期增强tswv的复制。

2、研究内容

3. 研究的方法与方案

1、研究方法：

（1）本氏烟总RNA提取：按试剂盒说明书提取本氏烟总RNA；

（2）反转录合成cDNA：以PV506为引物，本氏烟总RNA为模板，PCR反转录得到cDNA，纯化回收，保存待用；

（3）构建DCP2模板：取1.5ul cDNA为模板，以PV505PV506 为引物，Primestare扩增NbDCP2（1000bp），NbDCP2加A，20ul体系，70℃处理20min，与pGEM-T载体连接，4℃过夜。转化，用M13/FPV506筛选阳性克隆，得到pGEM-T-NbDCP2-1000bp模板；

（4）构建沉默表达载体，p2300-35S:intron-AtDCP2:以pGEM-T-NbDCP2模板，稀释50倍，PV507,PV506 Primestar扩增NbDCP2（500bp），加A后连接pGEM-T，转化后用M13/FPV507筛选阳性克隆，得到pGEM-Nbdcp2-500bp (pWJY90)；M13/RPV507筛选阳性克隆，pCXSN-NbDCP2-1000bp。KpnIBamHI双酶切，连接到p2300-35S: Intron-KpnIBamHI上，用XT307PV506筛选阳性克隆,得到阳性克隆p2300-35S: Intron-NbDCP2；p2300-35S:Intron-NbDCP2-XbaI单酶切后与pJMY- XbaI SpeI连接，XT307PV507筛选阳性克隆，得到p2300-35S: Intron-NbDCP2- dsRNA，PCR验证和酶切验证后转农杆菌GV3101。

（5）浸润植株：农杆菌处理液处理后，OD调至0.6。按下表的设计每个实验处理注射3株本氏烟，每株分别浸润3个叶片，记作1，2，3。

（6）摩擦接种毒源：植株浸润24h后，进行摩擦接种。取0.35g新鲜毒源，用3.5mL 0.01mM PB研磨，记作原浓度；稀释5倍；稀释10倍。按下表设计接种48h（第2天）后开始按3，2，1的顺序收集接种叶。

（7）Western检测：分别取0.25g叶片加入500ul 1xPBS研磨，研磨后，10000rpm离心10min，取10ul上清上样进行检测。

（8）分析讨论实验结果，与沉默表达进行对比。整理资料。

2、技术路线

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3、可行性分析

（1）指导老师实验室已建立了相对成熟的植物病毒生物学、分子生物学、电镜技术等研究体系（包括病毒提纯、电镜负染观察、温室工作、载体构建、多抗血清制备、SDS-PAGE、Western Blot等），因而本项目的实施在技术上是可行的。

（2）指导老师实验室对TSWV的研究已经积累很好的工作基础，已发表多篇论文，可为研究过量表达Dcp2对TSWV的复制影响中提供重要的研究经验。

（3）本项目依托单位为南京农业大学植物病理国家级重点学科单位，国家211工程重点建设学科单位，农业部 植物病原生物研究所及农业部病虫监测与治理重点开放实验室，拥有先进的现代化仪器与设备，为开展本项目研究工作提供了良好的硬件条件。

4. 研究创新点

本项目有具体的科学问题、明确的研究主线和关键研究切入点，并具有新颖的科研思路和合理的技术路线。

虽然前人对病毒的加帽机制展开过研究，但从未研究过脱帽酶dcp2对植物病毒复制的影响。tswv是tospovirus属中最重要的一种病毒, 它侵染82科800多种单、双子叶植物, 广泛分布于世界各地。它在一些重要的作物(如花生、烟草、番茄等)上造成重大的经济损失，由于该病毒可在杂草上存活和对传播介体--蓟马控制难度大, 因而在田间无有效措施防治该病毒。目前最有希望的是通过培育抗病品种来防治tospovirus病毒。鉴于tswv 和其他tospovirus病毒分布广泛, 用传统生物学和化学方法难于控制这些病毒和传毒介体，迫切需要通过基因工程改良寄主植物抗性。

本课题着重研究mrna脱帽蛋白dcp2在沉默表达时对tswv病毒复制的影响。我们希望通过研究脱帽蛋白dcp2对tswv复制的影响，将外源基因导入作物基因组中，为培育抗性品种提供理论依据。本课题与实验室其他项目结合，不仅可为研究番茄斑萎病毒的基因功能和致病分子机理提供一个重要的研究平台，同时也将利用基因工程操作技术开辟植物负义链rna病毒反向遗传学研究的新途径。

5. 研究计划与进展

研究计划：

2013年8月-2013年9月

（1） 抽提抽提本氏烟总rna，用pv506和pv509合成cdna，pv505pv506 primestae扩增nbdcp2（1000bp）,加a后连到pgem-t载体上，转化后用m13pv506筛选阳性克隆，得到pgem-t-nbdcp2（pwjy85）模板。