1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、本课题的意义：
rddm是植物中一种重要的dna甲基化修饰机制，目前研究表明其与基因印记现象存在联系，存在一类在胚乳中特异表达的pol Ⅳ转录的sirna受母系印记的控制，并且参与rddm通路介导dna甲基化的修饰。
本实验室目前发现两个在胚乳中特异性表达的母系印记sirnas，是由两个启动子pro1和pro2(由于这两个能产生印记sirnas的启动子由本实验室首次发现，还未公开发表，在本文论述中先由pro1和pro2代表)分别产生。为进一步验证这两个母系印记的sirnas是参与rddm通路，利用野生型和rdr2突变体材料进行互交实验。检测其24nt sirna的表达发现这两个sirnas的产生受rddm通路中rdr2的影响。利用重亚硫酸盐测序技术检测这两个位点三种甲基化程度，结果表明pro1和pro2产生的sirnas会参与rddm通路并介导基因的甲基化。通过rt-pcr验证了这两个位点的基因表达也是受印记sirnas控制。由此我们可以得出结论：在内源的情况下，pro1和pro2会产生母系印记sirnas，并且参与rddm通路介导基因的甲基化，相应的基因表达也受母系印记sirnas的控制。
2. 研究的基本内容和问题
本实验计划构建一个遗传筛选体系，为开展后续的遗传筛选工作，进一步研究这两个印记siRNAs的产生机制做准备。
本研究在外源的条件下，利用GATE WAY 克隆技术，构建pro-GFP克隆，通过农杆菌介导将其转基因到野生型和RdDM通路的突变体材料中，GFP（Green Fluescent Protein ）是绿色荧光蛋白，它在基因表达的情况下会发出可被检测到的绿色荧光。我们在后期对转基因材料进行蛋白杂交印记（western blot）和GFP荧光检测可以验证该体系是否与这两个位点在内源基因的表达情况一致。如果达到预期实验效果，则表明该遗传筛选体系构建成功，GFP的亮度即反映了这两个印记siRNAs所控制的基因表达水平。进一步的遗传筛选可以对转基因野生型材料进行一定处理筛选单拷贝纯合材料，进行EMS诱变筛选GFP荧光变亮的突变体，进行基因定位，研究基因与印记siRNAs产生的关系。
3. 研究的方法与方案
一、研究方法：
本研究在外源的条件下，利用gate way 克隆技术，构建pro-gfp克隆，通过农杆菌介导将其转基因到野生型和rddm通路的突变体材料中，gfp（green fluescent protein ）是绿色荧光蛋白，它在基因表达的情况下会发出可被检测到的绿色荧光。我们在后期对转基因材料进行蛋白杂交印记（western blot）和gfp荧光检测可以验证该体系是否与这两个位点在内源基因的表达情况一致。如果达到预期实验效果，则表明该遗传筛选体系构建成功，gfp的亮度即反映了这两个印记sirnas所控制的基因表达水平。进一步的遗传筛选可以对转基因野生型材料进行一定处理筛选单拷贝纯合材料，进行ems诱变筛选gfp荧光变亮的突变体，进行基因定位，研究基因与印记sirnas产生的关系。
二、技术路线：
4. 研究创新点
研究在外源的条件下，利用GATE WAY 克隆技术，构建pro-GFP克隆，通过农杆菌介导将其转基因到野生型和RdDM通路的突变体材料中，它在基因表达的情况下会发出可被检测到的绿色荧光。我们在后期对转基因材料进行蛋白杂交印记（western blot）和GFP荧光检测可以验证该体系是否与这两个位点在内源基因的表达情况一致。如果达到预期实验效果，则表明该遗传筛选体系构建成功，GFP的亮度即反映了这两个印记siRNAs所控制的基因表达水平。
5. 研究计划与进展
2013年12月-2014年1月 | 完成GATEWAY克隆和拟南芥转基因工作 |
2014年2月-4月 | 筛选F1代阳性苗 |
2014年4月-5月 | Western blot检测 GFP荧光检测 |
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