细菌harpin蛋白HrpZPsg结构域克隆和表达及功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

植物病原细菌的hrp基因簇除负责编码组装Ⅲ型分泌系统(t3ss)以及调控其他致病相关基因外，还编码能够激发非寄主或抗性植物过敏反应（hypersensitiveresponse,hr）的非特异性蛋白激发子harpin蛋白。1992年韦忠民首次从梨火疫病菌（erwiniaamylovora）的hrp基因簇中鉴定到harpinea蛋白，能够在在烟草上激发hr，并且hr可以被真核生物代谢抑制剂抑制[1]。随后对harpin蛋白的研究得到广泛开展。harpins蛋白的共同理化特征是均富含甘氨酸（gly），少量或不含半胱氨酸（cys），对热稳定，对蛋白k敏感，具有hr的功能域。harpins通过iii型泌出通道被运输到植物细胞内，在病原细菌侵染植物的过程中发挥作用。除harpinpss外，其他harpin均可以作为病原细菌的毒性因子起作用[2]。

迄今为止，关于harpin蛋白的研究结果所反映的均是蛋白质激发子与非寄主植物的相互作用。harpin至少可以激活3条信号通路，不同信号通路介导了不同的生物学效应。harpin可以通过启动水杨酸（salicylicacid,sa）信号通路使植物获得系统抗病性（systemicacquiredresistance,sar）[3-4]。harpin蛋白还可以通过启动茉莉酸（jasmonicacid,ja）/乙烯（ethylene,et）信号途径诱导植物抗虫与促进植物生长[5]，通过启动脱落酸（abscisicacid，aba）信号通路诱导植物抗旱[6]。但harpin激发子在植物上的受体是什么和如何相互识别这一重要问题还不清楚。hoyos等人进行了有意义的探索，发现harpinpss的作用位点在细胞壁上，并且可能与细胞壁的果胶化物结合，需要ca2 离子参与[7]。kim和miao等人也推测harpin蛋白的作用位点也在细胞壁上[8-9]。而lee等人研究则表明harpin(hrpzpsp)可以同时与烟草的微粒体膜和原生质膜结合，从而认为hrpzpsp与植物的结合位点位于原生质膜[10]。但是受体位于细胞中的哪一个部位尚没有统一的结论。推测不同harpins可能有不同受体，或同一种harpin可能不止一个受体。要解决这些问题，了解harpin蛋白的作用细节以及如何与受体蛋白相互作用，首先要认清harpin蛋白自身的空间结构和作用功能域。但是，迄今为止还未获得任何一种harpin的晶体结构。虽然有些harpin蛋白已经发现了hr功能域[11-12]。但在功能域研究方面也没有取得较大的突破。

本项目前期已从丁香假单胞大豆致病变种（pseudomonassyringaepv.glycinea）克隆到大小为1038bp的hrpz基因，并利用大肠杆菌表达。研究表明，harpin（hrpzpsg）具有该类蛋白的典型特征，如对热稳定，对蛋白k敏感，在非寄主植物激发hr等。hrpzpsg可以促进烟草的生长，显著提高烟草对tmv和疫霉的抗性。作用机理研究表明hrpzpsg能激发hcd标志基因hsr203j、hsr515的表达，同时伴随sar正调控因子npr1，植保素合成限速酶基因pal，pr蛋白家族基因pr-1a、chia5的表达，但未检测到乙烯信号通路的转录调控因子ein2的表达，说明hrpzpsg诱导烟草产生的sar是依赖于水杨酸信号途径[13]。为了研究hrpzpsg的作用机理，本项目鉴于harpin蛋白结晶分析工作的困难性，本项目拟解析决定hrpzpsg生物学效应的功能结构域，采用分子生物学等方法，对hrpzpsg进行片段缺失、替换和重排等，得到重组的hrpzpsg；采用促生、抗病等表型实验研究重组hrpzpsg的生物学效应。研究能为改造harpin类激发子，提高该类产品的应用稳定性和效果提供靶标分子。

主要参考文献

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标、内容

本项目以丁香假单胞大豆致病变种（pseudomonassyringaepv.glycinea）s1菌株的harpin（hrpzpsgs1）为研究对象。采用分子生物学和生物化学等方法，研究hrpzpsgs1中决定诱导非寄主植物hr、促进植物生长、诱导植物抗病性等生物学效应的功能区域。

拟解决的关键问题

3. 研究的方法与方案

研究方法

本项将采用反向pcr、重叠pcr和定点突变等分子生物学技术对hrpzpsg进行片段缺失、替换和重排等，得到重组的hrpzpsg；利用镍层析柱和凝胶层析的方法分离和纯化蛋白质；采用促生、抗病等表型实验研究重组hrpzpsg的生物学效应。

技术路线和实验方案

4. 研究创新点

特色或创新之处

Harpin蛋白是极具潜质的开发新型微生物蛋白肽类农药的候选物。蛋白质的空间结构和功能域决定着其功能，然而目前尚无对Harpin蛋白空间结构研究的报道，对其功能域也尚无统一的定论。在无法获得空间结构的情况下，开展harpin蛋白功能结构域的研究工作为了解其生物学效应机制提供一条可行的途径，为研究harpin蛋白的空间结构提供理论基础，也为提高harpin蛋白的稳定性和应用效果、创制高效多功能的蛋白类生物农药提供可改造的靶标位点。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

2013.08.02-2013.10.20熟悉实验室各仪器及操作，进行hrpzpsgs基因功能域的克隆以及烟草的种植与培养

2013.10.21-2013.11.31进行几个个功能域的蛋白表达及纯化