大麦成熟胚愈伤组织诱导及转化效率的提高开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

大麦是世界上重要的粮食作物之一，大麦原产于中东地区，在我国种植历史距今已有5000年，主要用于动物饲料、麦芽制造、食品制造、医药等方面,但在某些高寒、干旱和盐碱地区至今仍是主要粮食作物。

在粮食作物中，大麦属于遗传转化最为困难的作物之一，其主要原因是缺少高效的大麦组织培养体系，虽然已报道使用大麦胚、分生组织、小孢子和原生质体等外植体获得了再生植株，但频率较低。

大麦成熟胚愈伤的诱导研究主要集中在诱导率、诱导条件对分化率的影响以及诱导出的愈伤质量对转化率的影响等方面。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标 明确影响大麦成熟胚愈伤组织诱导效率的因素，本研究选用国内品种花30和国外品种golden promise作为对照，通过农杆菌（gv3101和agl1）介导转化gfp基因，研究影响农杆菌转化效率的因素，建立高效转化体系。

2.研究内容 影响大麦成熟胚愈伤组织诱导的因素，包括大麦基因型、种子切割方式、培养基成分、激素添加、培养环境。

影响农杆菌转化效率的因素，包括外植体类型、农杆菌菌株类型、侵染时间、侵染浓度、培养基类型、是否添加乙酰丁香酮等。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法与试验方案①愈伤组织的诱导：选取花30和golden promise两个品种的大麦种子若干，用20%次氯酸钠和70%的乙醇进行消毒，在超净工作台上用镊子固定种子，然后在超净工作台无菌条件下，用解剖刀沿盾片处轻轻将胚与胚乳分割，本实验采用纵切，将胚倒置于诱导培养基，将培养皿放置在培养箱内25℃黑暗条件下诱导愈伤组织。

②统计出愈率：暗培养3天左右，可见有初级愈伤组织出现，接种后两周可获得初代愈伤组织，此时统计每个大麦品种成熟胚初级愈伤组织的诱导率。

计算诱导率：愈伤诱导率（%）=（出愈外植体数/接种外植体数）100 ③农杆菌活化：（1）将含有gfp的农杆菌菌株gv3101和agl1均匀涂布在含 25mg/l的利福平rifampicin（简写为rif）和 25mg/l卡那霉素 kanamycin（简写kan）的固体mgl 培养基上,涂抹体积为10μl于28℃倒置培养 2-3 天； 用白色枪头挑取农杆菌单菌落于5ml mgl液体培养基（含25mg/l rif和25mg/l kan）中，封口，在28℃、200r/min 摇床中振荡培养过夜至浑浊；进行菌液pcr检测；取阳性菌液 400μl左右接种于10ml mgl液体培养基中（含25mg/l rif和25mg/l kan），28℃，200r/min震荡培养至od600=0.6-1.0左右；④农杆菌侵染：（1）从-80℃超低温冰箱中取出农杆菌菌株gv3101和agl1，用枪吸取10μl或50μl菌液均匀涂布于mgl平板上，28℃培养箱中倒置培养；挑取农杆菌单菌落于5ml mgl液体培养基中，28℃，200r/min震荡培养过夜至浑浊；对菌液进行pcr扩增检测；挑选阳性菌株于4℃保存，取阳性菌株菌液1ml接种于50ml mgl液体培养基中），28℃，200r/min震荡培养至 od600=0.6-0.8 左右；把菌液均装在50ml离心管中（不可装太满，以免溢出），4℃，10000r/min离心10min,弃上清；用4m l 含有100μmol/l as的侵染液重悬菌体，4℃，10000r/min离心10min，弃上清，用侵染液（含100μmol/l as）重悬菌体，调节至od600=0.4左右，振荡培养40min。

4. 研究创新点

特色或创新之处大麦的品种改良现多集中于应用杂交育种方法，对于大麦遗传转化研究的较少。

大麦成熟胚由于取材不受时间限制，数量也可以保证，是进行生物技术研究的一个良好试验系统。

但成熟胚培养诱导的胚性愈伤组织质量较差，基因型的差别也非常大，大部分品种难以再生。

5. 研究计划与进展

1.研究计划2017.9-2017.12开展试验研究，诱导大麦成熟胚愈伤组织，做大量重复，找到提高出愈率的最佳方式，统计数据并拍照。

进行农杆菌侵染，观察转化情况。

2018.3-2018.5再次做重复实验，对已分化的愈伤组织继代培养。