葡萄炭疽病菌对嘧菌酯抗药性检测及抗药性菌株生物学性质开题报告

一．课题意义：

据国家农业部统计，截至2015年底，中国葡萄栽培面积达1198.5万亩，比2014年增长0.4%，产量1366.9万t，同比增长9.0%，葡萄酒产量114万t。从2011年起鲜食葡萄产量已稳居世界首位，从2014年起葡萄栽培面积已跃居世界第2位，葡萄酒产量居世界第8位，中国已经成为世界葡萄生产大国。特别近10年来，葡萄栽培面积、产量迅猛上升。面积由2005年的612万亩增长到2015年的1198.5万亩，增0.96倍;产量由2005年的579.4万t增长到2015年的1366.9万t，增长1.36倍^[1]。葡萄在我国已经被广泛种植。葡萄炭疽病在我国大多数葡萄栽培地区均有分布，南方产区（黄河以南，尤其是长江流域及以南地区）普遍发生，北方地区（东北、河北、山西、陕西、河南和山东北部）尤其是环渤海湾地区比较严重，西部地区发生相对较少。葡萄炭疽病是葡萄上的重要病害，在多雨、潮湿的地区发病普遍，流行年份病穗率可达50%以上，其中感病品种可达70%以上，可引起果实大量腐烂，造成严重减产^[2]。

二．国内外研究概况：

1.1 葡萄炭疽病的研究现状

葡萄炭疽病也称晚腐病、苦腐病，是葡萄近成熟期危害果实的重要病害之一^[3]。1891年Southworth首次对葡萄炭疽病进行了报道^[4-5]，通过对美国东部、西南和西部的中部地区炭疽病发生情况调查发现，该病在高温多雨的年份常造成严重的损失，而在降雨较少，环境湿度较低的地区和年份葡萄炭疽病发病程度较轻。

胶孢炭疽菌是是引起炭疽病的病原菌之一，其寄主广泛，主要造成果实腐烂，也有叶斑等症状。不同的专化型可以侵染多种不同的作物，如葡萄、苹果、梨、芒果、茶、枸杞、橡胶、番茄、辣椒、草莓、桃等。且因与寄主之间协同进化和受环境影响，胶孢炭疽菌产生的变异相对较多，也较快^[6]。因此，对这些变化的跟踪和研究也非常有必要，国内外也有很多相关研究。

1.2 症状

葡萄炭疽病有潜伏侵染的特性，主要危害着色期和近成熟期的果实，也可危害幼果、叶片、叶柄、新稍、卷须、花穗、穗轴和果梗等^[2,7-9]。危害初期在组织上表现症状不明显。 危害果实时，在幼果期侵入并潜伏，得病果粒表现为黑褐色、蝇粪状病斑，等到成熟期（或果实呼吸加强时）发病。成熟期或着色后的果粒发病后，初在果面上产生针头大小的褐色斑点，其后随着果实的成熟病斑逐渐扩大，呈现褐色或玫瑰色、水渍状圆形及不规则斑，直至凹陷、腐烂^[10]。后期在病斑表面逐渐生长出轮纹状排列的小黑点，即病菌的分生子盘，天气潮湿时病斑上长出粉红色黏状小点，即病菌的分生孢子团，这也是炭疽病的典型症状。发病严重时，病斑可扩展到半个或整个果面，果粒软腐，易脱落，病果酸而苦，或逐渐干缩形成僵果。果实病害多在植株下部果穗上发生^[11]。 花穗受害时，可在花穗轴、小花、小花梗上出现淡褐色、湿润状不定形病斑，以后逐渐变黑、腐败、轻摇，易脱落，湿度大时，腐败花穗上可长出白色

菌丝和橙红色粘稠物质^[12]。叶片受侵染，多从叶缘开始，逐渐向中央扩展形成褐色或红色的近圆形病斑、大小不等，具同心轮纹，后期出现黑色分生孢子盘和粘稠粉红色分生孢子团^[2,13]。嫩梢、叶柄、果梗、穗轴受害后出现梭形或圆形、暗褐色凹陷斑；果梗、穗轴发病严重时可使果粒和果穗脱落或干缩。穗轴、当年的新生枝蔓、叶柄、卷须得病，一般不表现症状，在第二年有雨水时产生分生孢子盘，并释放分生孢子成为主要的侵染源^[13,14]。

1.3 病原菌

炭疽菌分布广泛，且寄主繁多，能够危害多种作物，树木、观赏植物等，尤其是对经济苗木、果树造成严重的危害^[10,15-17]。炭疽菌属是由Tode于1790年首次发现，并将其归为Vermicularia（丛刺盘孢属）^[18-20]。此后，炭疽菌属、种上的划分一直处于混乱状态，异名接近600种^[21]。其中使用最广泛的属名有：丛刺盘孢属（Vermicularia Tobeex Fr.）、刺（毛）盘孢属（Colletotrichum Cda）（1831）、盘长（圆）孢属（Gloeosporum Desmet Mont）（1849）和盘圆孢属（Gloeosporiumauct Vsensu Sacc.）（1882）^[22]，最后由 Duke ( 1928 )、Von Arx（1957）和Sutton（1980）等确认 Colletothrichum 为唯一属名^[23]。以上所提及的广泛使用的 4 种属名，其划分的主要依据是分生孢子盘上刚毛的有无、多少和着生状态^[24]。1957年Jvonarx报道，刚毛的有无和多少不是稳定性状，不能作为分类的依据，并建立了以自然基物上繁殖体形态学为基础的炭疽菌分类系统，主要是以分生孢子和附着胞形态作为分类的依据。Sutton等在1992年系统地描述了炭疽菌属名称变化历史^[25]。1987年王晓鸣根据1957、1970年Arx和1980年Sutton的分类系统，提出自然形态特征为主，培养特征和寄主范围为辅的综合特征作为分种的依据^[26]，并提议此属的中文名称为炭疽菌属，该属的主要特征是孢子萌发产生附着孢，产孢细胞瓶体。附着孢及孢子的形态是炭疽菌分类的重要依据^[27]。

引起葡萄炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides (Penz.) Sacc.）和尖孢炭疽菌（C. acututam）。在我国引起葡萄炭疽病的多为胶孢炭疽菌，属于半知菌亚门（Deuteromycotina）、腔孢纲（Coelomycetes）、黑盘孢目（Melanconiales）、炭疽菌 属 （Colletotrichum）^[22]。 有性世代属于隶属于真菌界（Fungi)、子囊菌门（Ascomycota）、盘菌亚门（Pezizomycotina）、粪科菌纲（Soradariomycetes）、黑痣菌目（Phyllachorales）、黑痣菌科（Phyllachoraceae）、小丛壳属（Glomerella Sch. et Spau.），自然条件下罕见。 Suzaki对葡萄炭疽病的研究表明引起该病的病原菌为胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides^[19]。在国内引起葡萄炭疽病的主要病原是胶孢炭疽菌，鲜有尖孢炭疽菌的报道。 胶孢炭疽菌在病果上分生孢子盘呈暗褐色至黑色的垫状突起，圆形至椭圆形。分生孢子盘产生于表皮下，成熟后突破表皮。分生孢子盘排列一圈，为圆形，随着病斑的扩展，成为多个圆圈，为轮纹状排列。分生孢子盘释放黏状、肉红色分生孢子。分生孢子梗为无色单胞，圆筒形或棍棒形，两头钝圆，中间凹陷，两端不对称，大小为12~26μm3.5~4μm。分生孢子无色，单胞，圆形或椭圆形，一端稍小，内含数个油球。附着胞褐色，形状为菱形扁球形和不规则形。有性阶段围小丛壳的子囊壳聚生，在病斑上排列为轮纹状，瓶型，深褐色，直径125~320μm。子囊棍棒状，无柄，55~70μm9~16μm，壁可消解。子囊孢子椭圆形，略弯，无色，单胞，12~28μm3.5~7μm^[28]。自然条件下，没有在葡萄上发现有性阶段。胶孢炭疽

研究方法

按照浓度梯度将嘧菌酯母液稀释，配置药皿培养在句容采集的多种葡萄炭疽菌株，采用菌丝生长速率法测定EC₅₀。沿着活化好的病原菌菌落边缘打取5mm菌碟，转接到加有药剂的培养皿中，每个浓度三个重复，对照为不含药剂的培养皿。然后放到25℃培养箱中倒置培养5天，测定菌落直径。利用DPS软件中的毒力回归方程Y=a bx计算药剂抑制菌丝生长的有效中浓度（EC₅₀）作为毒力参数。筛选出抗性菌株 ，并测定MIC。

技术路线

实验方案

1.供试药剂与培养基

98%嘧菌酯原药（fludioxonil），药剂预溶于甲醇配制成104 μg mL1的储备母液。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯20g，葡萄糖20g， 琼脂粉16g，用蒸馏水定容至1 L。

培养基经高压高温灭菌后，常温保存。

2.葡萄炭疽病菌对嘧菌酯敏感性基线的建立

采用菌丝生长速率法测定江苏省镇江市句容葡萄产区采集的80株葡萄炭疽病菌。